花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用技术

本发明专利技术属于植物分子遗传学和作物分子育种技术领域，提供一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用，分子标记包括InDel标记PM16‑6和PM16‑8，其分别位于花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的两侧，标记PM16‑6的引物如SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4所示，标记PM16‑8的引物如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示；利用所述两个标记实现对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点等位变异在杂交后代中的分子标记辅助选择，进而实现对花生籽仁可溶性糖含量的分子标记辅助育种，两个标记选择正确率均在98.87％以上，具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点。

Molecular marker of soluble sugar content related sites in peanut kernel and its application

【技术实现步骤摘要】
花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用
：本专利技术属于植物分子遗传学和作物分子育种
，特别涉及花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法及其应用，主要用于花生籽仁可溶性糖含量的分子标记辅助育种，以及与花生籽仁可溶性糖含量相关的品质、产量、耐逆性等相关的分子标记辅助育种。
技术介绍
：花生是我国重要的油料经济作物，但其单产、总产、出口量及产值在五大油料作物中一直位居首位，花生籽仁营养丰富，主要含有蛋白质(12.48％-36.82％)和油脂(32.35％-60.21％)，两者之和超过75％(万书波,封海胜等2004)。花生既可直接食用，又是食品原料，糖分含量是其重要的品质性状。随着人们对花生营养的全面认识，作为全籽仁食品的比例逐年增加，口感甜度高的花生越来越受到消费者的青睐。最直接影响花生口感甜度的因素即其籽仁的可溶性糖的含量。花生籽仁中的糖主要由可溶性糖和非可溶性糖组成，而可溶性糖主要是蔗糖、果糖和葡萄糖等。葡萄糖是高等植物光合产物的主要直接产物，继而转化为蔗糖的形式进行运输，进入储藏器官后再分解为单糖转化为其他储藏物质进行储存，是农作物产量形成的物质基础。在可溶性糖中，蔗糖所占的比例最大，花生的品尝甜味主要来源于蔗糖(Basha.etal.1992；Oupadissakoon,Youngetal.1980)。另外，有研究表明种子含糖量的降低会导致种子对低温的敏感(Uemura,Warrenetal.2003)，反之提高种子的含糖量，在种子的抗逆性尤其是发芽阶段对低温和盐碱的耐受性中也将具有重要的意义(Shi,Wangetal.2016；Sui,Yangetal.2015)。尤其是当下花生种植区域向辽宁、吉林等高纬度春季低温地区以及盐碱地等区域发展，利用改良花生籽仁中的可溶性糖含量来提高花生的耐逆性也将是一个新的途径。鉴于此，发掘花生籽仁中可溶性糖含量的关键遗传位点，将为分子遗传手段改良花生的籽仁可溶性糖含量提供理论依据。关于籽仁可溶性糖含量的遗传位点在多种植物中已经有一定的研究。在对玉米籽粒可溶性糖含量的研究中发现了两种类型的甜玉米：一类是淀粉合成功能缺失，主要是由sh2和brittle2基因引起的，两者均编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase)，在多糖合成中发挥作用。这两个基因的突变体胚乳中累积较多的可溶性蔗糖，籽粒不透明(Laughnan,1953；Bhave,Lawrenceetal.1990)。另外一类是淀粉颗粒组装的问题，以su1(sugary1)及其隐性调节子se1(sugaryenhancer1)基因为主要调控因子。Su1基因编码一个淀粉异构酶(Isoamylase)，在多糖的分枝发育中发挥作用(James,Robertsonetal.1995)，它们的功能缺失，产生可溶性的多分枝的植物多糖，主要是麦芽糖，籽粒是半透明的(Ferguson,Dickinsonetal.1979；Folgadoetal.2014；Carey,Dickinsonetal.1984)。水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的功能失活同样会形成糖化和皱缩半透明的籽粒(Yano,Isonoetal.2008；Tuncel,A.etal.2014)。另外水稻淀粉合成酶的磷酸化所需要的激酶SPK(Calmodulin-likedomainproteinkinase)的失活也会形成充满蔗糖而缺少淀粉的水稻籽粒(Asano,T.etal.2002)。除了以淀粉为储藏物质的谷物(胚乳)，对子叶类植物籽仁含糖量的研究较少。在拟南芥的研究中发现：种子中碳水化合物的代谢相关基因的功能变化会导致籽仁中(子叶中)油分和糖分的变化，例如编码一个乙烯响应的AP2/ERWEBP型的转录因子wrinkled1基因的突变会导致种子中的油分降低，可溶性糖含量增加(Focks,Benningetal.1998；Ma,W.etal.2013)。在对甜高粱的研究中，也通过正向遗传学的手段，克隆到了控制甜高粱茎秆含糖量的持汁基因Dry，该基因是一个植物特有的NAC转录因子，在高粱的栽培驯化中受到了强烈的人工选择(Zhang,L.,etal.2018)。花生籽仁主要由两片占种子绝大部分的子叶构成，其主要的储藏物质为油脂和蛋白质(之和超过75％)，光合作用产生的碳水化合物主要以蔗糖的形式运送到发育中的种子中，之后在蔗糖转化酶的作用下水解为葡萄糖或果糖，在一系列的酶作用下经过乙酰辅酶A合成为油脂或蛋白质(Weber,Borisjuketal.1997)。这些储藏物质的合成途径中有相当多的遗传因子发挥作用(JA,W.etal.2001)，而到底是那些基因发生变异会导致种子中可溶性糖含量的增加至今没有一个清楚的认识。Basha等对152份种质资源的研究发现：花生籽仁中可溶性总糖含量的遗传多样性较高，变幅为2.84％-19.98％，蔗糖含量的变幅为2.73％-14.65％(Basha,S.M.1992)。Harold等分离并测定了52个不同品种的20种不同的碳水化合物成分，结果发现其中有9种受到环境的影响，5种在花生类型中表现差异，11种因基因型和环境互作表现差异，其中基因型变异占38％-78％，同时发现碳水化合物的变异与烤花生的风味差异密切相关(HaroldE,Pattee.etal.2000)。王秀贞等对花生的粒级间蔗糖含量和可溶性总糖进行的研究发现，三级米(秕粒)的含糖量要普遍高于一、二级米，这与前人研究发现的收获越早籽仁含糖量越高的现象相一致，也从侧面说明了花生的可溶性糖可能主要来自于光合产物的非完全转化为储藏物质。Isleib等通过杂交及其后代的研究发现：花生籽仁的可溶性糖含量主要受加性基因效应控制，同时发现蔗糖含量在正反交中差异显著(Isleib,Pattee.etal.2004)。还有一些关于花生种皮颜色、遮光覆膜、土壤肥料等对花生含糖量的影响的研究，充分表明花生籽仁可溶性糖含量是一个受多因素影响的复杂数量性状。已有的研究仅限于此，还未见对花生籽仁可溶性糖含量这一品质性状较为系统及分子遗传方面的研究。未见对花生籽仁可溶性糖含量相关基因位点或连锁的分子标记的报道，本专利技术提供两个与花生籽仁可溶性糖含量相关的主效位点连锁的分子标记及其在花生籽仁可溶性糖含量的遗传改良中的分子标记辅助选择的应用方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供两个与花生籽仁可溶性糖含量相关位点紧密连锁的分子标记，利用该分子标记，可以快速准确地对花生籽仁可溶性糖含量性状进行分子标记辅助的种质鉴定，同时可以在杂交育种中对后代的籽仁可溶性糖含量进行分子标记辅助选择，以提高花生籽仁可溶性糖含量相关的育种效率。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术提供一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，所述分子标记包括InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8，InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，与其有多态性差异的目标区序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：所述分子标记包括InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8，InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与其有多态性差异的目标区序列如SEQ IDNO:2所示；InDel标记PM16-8位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，与其有多态性差异的花生品种的目标区序列如SEQ ID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
20200304 CN 20201014321881.一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：所述分子标记包括InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8，InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，与其有多态性差异的目标区序列如SEQIDNO:2所示；InDel标记PM16-8位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，与其有多态性差异的花生品种的目标区序列如SEQIDNO:6所示。


2.根据权利要求1所述花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：
InDel标记PM16-6的优选引物对为：
PM16-6-F:5`-TTCTATCTATTTCCCAAAGACGAC-3`，
PM16-6-R:5`-AATTCTATTTTACCTTACTGACGG-3`；
InDel标记PM16-8的优选引物对为：
PM16-8-F:5`-TCGGGCCATGCACACCCCTAAT-3`，
PM16-8-R:5`-CCATCCCTACCTGTAAACCACT-3`。


3.根据权利要求1所述花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：所述的InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8分别位于花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的两侧，与该位点紧密连锁，两个标记间连锁率超过98.87％，重组率约为1.13％；标记PM16-6和PM16-8间的遗传距离为1.13cM。


4.一种花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)针对由高可溶性糖含量和低可溶性糖含量的双亲杂交或回交育种，提取亲本及其杂交后代待测花生植株的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述分子标记PM16-6的引物对和分子标记PM16-8的引物对中的一对引物或两对引物，对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶通过硝酸银染色显影后，进行带型判读，根据扩增产物的条带大小及与双亲带型的关系确定杂交后代的标记基因型，将杂交后代的扩增条带与亲本的扩增条带进行比对，如果后代个体的扩增条带...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓军，赵瑞华，于晓娜，司彤，邹晓霞，王月福，王铭伦，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37