用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法，基于甘蔗的ITS基因、rbcl基因、nsLTP基因、NDR1/HIN1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物和探针，使用上述引物和探针对待测样品中甘蔗成分进行检测，能将甘蔗与其他物种准确的分开，检测绝对灵敏度达0.4copies/μL，相对灵敏度可达0.01％，鉴定结果准确、稳定、可靠。

Specific primers, probes, kits and methods for the detection of sugarcane components

【技术实现步骤摘要】
用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种用于检测甘蔗成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
随着转基因产品的大量研究及其在日常生活中的广泛应用，转基因产品对人类健康以及生存环境所带来的安全性问题已经引起世人的广泛关注及争论。因此，世界各国在积极研究转基因技术的同时，也对各种转基因食品的检测分析方法进行了大量研究。但由于转基因种类多，数量大，尤其是很多转基因食品经过深加工和各种条件处理保存后，转基因成分大量降解，检测难度加大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新和发展各种转基因食品的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理，减少其商品化可能带来的风险，同时保护公众健康、保护广大消费者知情权和选择权。特异性基因检测在转基因检测、食品成分检测方法非常重要，食品转基因检测的第一步骤即为食品成分检测。在转基因定性检测中，特异性基因作为质量分数的分母使用。国家标准-转基因产品通用检测方法包括了玉米zSSIIb和Adh1、大豆Lectin、油菜CruA和PEP、水稻SPS和PLD、苜蓿ACC基因、甜菜GluA3、马铃薯UGPase，共7大作物的11个特异性基因实时PCR检测方法。而甘蔗是禾本科、甘蔗属的一个多年生高大实心草木。甘蔗广泛分布于热带及亚热带地区，是制造蔗糖的原料，而且可以提纯乙醇作为能源的替代品。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质。甘蔗含有的水分是相当丰富的，还有一定的润肺止咳的作用。甘蔗性寒，味甘，含有丰富的纤维素，能够帮助身体促进身体的消化，有助于缓解便秘的发生，促进胃健康。由于甘蔗具有良好的转基因商业化前景，需要根据科学技术的发展不断更新和发展开展甘蔗的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理。但甘蔗等重要的禾本科作物都没有成熟的特异性基因检测方法。例如，中国专利文献CN106636424A中一种基于甘蔗基因组序列开发的SSR核心引物，SSR核心引物含有28对引物，采用普通PCR结合毛细管电泳技术，主要用于甘蔗遗传多样性分析、品种鉴定和保护、DNA指纹图谱及遗传连锁图谱的构建。然而，上述专利的技术只能用于鉴定甘蔗这一物种内部不同样本的亲缘关系，无法区分甘蔗与其他物种。因甘蔗、小麦、黑麦、燕麦、黍等禾本科作物同源性较高，导致植物及其加工品中甘蔗成分的鉴别难度很大。因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、结果准确可靠且快速简便的用于检测甘蔗成分的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，采用所述引物检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。本专利技术要解决的第二个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的探针，采用所述探针检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。本专利技术要解决的第三个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的试剂盒，采用所述试剂盒检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。本专利技术要解决的第四个技术问题在于提供一种用于检测甘蔗成分的方法，采用所述方法检测甘蔗成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中甘蔗成分进行快速鉴定，效率高。为此，本专利技术提供了一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。本专利技术还提供了一种用于检测甘蔗成分的探针，其特征在于，所述探针具有如下序列：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。进一步地，所述探针的3′端标记有荧光淬灭基团，5′端标记有荧光报告基团。进一步地，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和MGB；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE和HEX。本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物和上述任一项所述的探针。本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物或上述任一项所述的探针。进一步地，试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。优选地，阴性对照可以但不局限于为无菌双蒸水、大米、小麦。进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶。本专利技术还提供了一种所述的特异性引物或上述任一项所述的探针或所述的试剂盒在检测样品中甘蔗成分的的应用；进一步地，所述样品为植物或者植物加工品。所述植物加工品为动物食品、植物食品、饮料、保健品、营养补充剂中的至少一种。本专利技术还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；(2)使用所述的特异性引物进行扩增和/或使用上述任一所述的探针进行特异性杂交，以检测所述DNA模板。进一步地，所述检测为PCR检测，优选为实时荧光PCR检测。本专利技术还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；(2)使用所述的引物对步骤(1)获得的DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有80～100bp的DNA片段，则所述待测样品中存在甘蔗成分；反之，则所述待测样品中不存在甘蔗成分。所述步骤(3)中所述80～100bp的DNA片段为91bp的DNA片段。所述的91bp的DNA片段序列如SEQIDNO：4所示，具体为GATCGCCACAGCAAGCTGCATGCGAGCCATGTCGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCCTGGGTGTGTGTGACGACCGTGTGCTAGTGCTA(全称：NDR1/HIN1-likeprotein，简称NDR1/HIN1基因I)本专利技术还提供了一种检测甘蔗成分的方法，包括如下步骤：(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；(2)使用所述的引物和上述任一所述的探针对步骤(1)提取的DNA模板进行实时荧光PCR扩增；(3)收集荧光信号，得出检测结果。进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，PCR反应体系包括：DNA模板，30～60ng；上游引物，10μM，0.5～1.5μL；下游引物，10μM，0.5～1.5μL；探针，10μM，0.25～1μL；2×TaqManUniversalPCRMasterMix12.5μL；无菌超纯水补至25μL；进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，按照如下PCR扩增程序进行：95℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：/n上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；/n下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘蔗成分的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物：5′-TCGCCACAGCAAGCTGCATG-3′；
下游引物：5′-TAGCACTAGCACACGGTCGTCAC-3′。


2.一种用于检测甘蔗成分的探针，其特征在于，所述探针具有如下序列：5′-CGATCGATGTTCTGGGTGCTGAGTGCC-3′。


3.根据权利要求2所述的用于检测甘蔗成分的探针，其特征在于，所述探针的3′端标记有荧光淬灭基团，所述探针的5′端标记有荧光报告基团。


4.根据权利要求3所述的用于检测甘蔗成分的探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和MGB；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE和HEX。


5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓婷婷，黄文胜，刘凤轩，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11