一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记和方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记及方法，属于水稻育种技术领域。本发明专利技术所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，PCR引物对正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。LDR探针包括一条荧光标记探针Probe‑FAM，序列如SEQ ID NO.3所示，一条籼型等位基因特异探针Probe‑ind，序列如SEQ ID NO.4所示，一条粳型等位基因特异探针Probe‑jap，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术方法不仅能准确快速的鉴定水稻品种或育种群体中各个株系中耐低温基因COLD1的基因型，而且能实现较多样品的高通量检测。与常规的分子标记基相比具有更加简便、快捷高效的优势。本发明专利技术提供的方法能进一步提高COLD1‑ind纯合基因型株系的选择效率，加快耐低温水稻品种的育种进程。

PCR / LDR molecular marker and method for identification of cold tolerance gene cold1 in Rice

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记和方法
本专利技术涉及水稻育种
，尤其涉及一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR的分子标记和方法。
技术介绍
水稻是起源于热带和亚热带地区的农作物，因此对低温胁迫非常敏感，尤其是苗期和孕穗期，这是限制水稻种植区域的一个主要因素。在水稻的种植过程中，由于人工的驯化和选择使粳稻种植区域延伸到年积温较低的温带和寒带地区。中科院植物研究所种康研研究组与中国水稻研究所钱前研究组以及其他合作者分析了127个不同水稻品种和野生稻中COLD1基因序列，发现了7个SNP位点，其中粳稻特异的SNP2影响了COLD1蛋白活性而赋予粳稻耐寒性。研究发现，包含粳稻COLD1基因的籼稻近等基因系以及超表达该基因的粳稻材料都显著增强了耐寒性，而功能缺失突变体cold1-1或RNAi株系却对低温非常敏感。COLD1基因编码一个G-蛋白信号调节因子，定位于细胞质膜和内质网。水稻处于低温胁迫是，COLD1蛋白与G-蛋白α亚基RGA互作，激活Ca2+通道，触发下游耐寒防御反应，使G-蛋白GTP酶活性增强。该成果揭示了通过驯化得到的COLD1等位基因和特异SNP赋予水稻耐寒性的新机制。粳型COLD1等位基因可直接用于对超级杂交稻亲本9311和其它籼粳稻的耐寒性改良，对基于分子辅助育种培育水稻耐寒新品种具有重要的应用前景(MaY,etal.,COLD1ConfersChillingToleranceinRice,Cell.,2015,160:1-13)。>聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerasechainreaction/ligasedetectionreaction,PCR/LDR)是今年来发展起来的一种核酸检测技术，该方法具有较高灵敏度、准确度，并且该方法能够实现多个遗传位点的同时检测，实现较高通量的基因型检测，在医学广泛的用于疾病的诊断(GibrielAAetal.，Advancesinligasechainreactionandligation-basedamplificationsforgenotypingassays:Detectionandapplications.MutatRes.,2017,773:66-90)。本专利技术利用PCR/LDR技术，开发了用于鉴定COLD1基因型的分子标记方法，可用于快速的鉴定水稻种质资源和育种群体中COLD1的基因型，相对于传统的分子标记方法具有经济、高效和高准确率的优势。
技术实现思路
本专利技术的技术问题：籼型和粳型COLD1基因第四个外显子中的一个单核苷酸多态性位点SNP2，在SNP2位点，粳稻为一个碱基A,而大多数的籼稻为碱基T。基于此，本专利技术针对传统基于PCR、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐，不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点，设计了一种基于PCR/LDR技术的分子标记，用于快速、准确的鉴定COLD1基因的基因型，为筛选鉴定携带有粳型COLD1等位基因水稻种质资源和耐低温胁迫水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。本专利技术第一个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：正向引物序列：5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’；(SEQIDNO.1)反向引物序列：5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’；(SEQIDNO.2)所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap：所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQIDNO.3所示：5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQIDNO.4所示：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’；所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQIDNO.5所示：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’。优选地，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。优选地，所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。本专利技术第二个目的在于提供上述分子标记在水稻育种过程对耐低温基因COLD1基因型的鉴定中的应用。本专利技术第三个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)水稻植株基因组DNA的提取；(2)利用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：正向引物序列：5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’；(SEQIDNO.1)反向引物序列：5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’；(SEQIDNO.2)(3)以PCR扩增产物为模板，用LDR探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap：所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQIDNO.3所示：5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQIDNO.4所示：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQIDNO.5所示：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’；(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。本专利技术提供的鉴定COLD1基因型的方法具体可包括以下步骤：(1)水稻植株叶片基因组DNA的提取：取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mMTris-HCl，15mMEDTA，1.05本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：/n正向引物序列：5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’；(SEQ ID NO.1)/n反向引物序列：5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’；(SEQ ID NO.2)/n所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap：/n所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：/n5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；/n所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：/n5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’；/n所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：/n5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’；(SEQIDNO.1)
反向引物序列：5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’；(SEQIDNO.2)
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap：
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQIDNO.3所示：
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQIDNO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’；
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQIDNO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’。


2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。


3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。


4.权利要求1-3中任一项所述分子标记在水稻育种过程对耐低温基因COLD1基因型的鉴定中的应用。


5.一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基...

【专利技术属性】
技术研发人员：储黄伟，曹黎明，程灿，涂荣剑，牛付安，周继华，孙滨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31