抗体纯化制造技术

本发明专利技术涉及从羊乳例如山羊乳中纯化异源抗体的方法。本发明专利技术包括基于蛋白A的亲和色谱法，以获得纯化的转基因表达的抗体，特别是不含内源性羊抗体的浓缩物。

Antibody purification

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体纯化
本专利技术涉及抗体的纯化，特别是在哺乳动物乳例如山羊(goat)乳中转基因表达和分泌的重组单克隆抗体的纯化。
技术介绍
抗体长期以来一直用于研究中，并广泛用于诊断中，最近又作为治疗剂或治疗诊断剂。抗体的研究用途主要包括特定抗原的检测，例如如Western印迹、免疫组织化学、流式细胞术等，或者作为替选地，可涉及特定抗原的分离。诊断类似地依赖于抗原的检测，所述抗原例如疾病特异性抗原，包括致病性抗原，还有自身抗原，例如与癌症或自身免疫病相关的抗原。在过去的几十年中，治疗性抗体变得越来越重要。当前市场上有大量治疗性抗体。这些抗体主要用于干扰特定的抗原功能，例如包括抗体的中和作用，但作为替选地可参与调节免疫系统，例如诱导或抑制特定的免疫应答。在2014年，单克隆抗体(mAb)占投放市场的新分子的20％以上。多克隆抗体的生产相对直接，而单克隆抗体的生产，尤其是以满足包括治疗用途在内的当今需求的量的生产，成本更高且劳动强度更高。尽管单克隆抗体通常源自杂交瘤，但大规模生产通常涉及分离抗体编码序列并在异源体系中重组地表达抗体。最直接的抗体生产体系涉及在细菌中克隆抗体编码序列，所述细菌可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌的一个优点是它们缺少外膜，从而有助于将产生的抗体分泌到培养基中。在细菌中产生抗体的一个主要缺点是抗体可能错误折叠，以及由于隔离在包涵体中而缺乏溶解性。另一个缺点是细菌通常加工蛋白质，因此特别是加工重组抗体，这与真核生物和细胞完全不同。特别地，抗体是糖基化的蛋白质，并且功能在某种程度上可取决于适当的糖基化(例如，稳定性和动力学、免疫应答等)。因此，缺乏糖基化或例如在细菌中观察到的不同糖基化模式可有害地影响抗体功能。因此，在真核系统中产生抗体的优势在于糖基化模式与天然糖基化更为相似。虽然许多不同类型的真核细胞(包括酵母细胞或其他真菌细胞、原生动物细胞或昆虫细胞)可用于抗体产生；但目前，哺乳动物细胞至少在治疗性抗体生产中是最广泛应用的。然而，一般而言，抗体是复杂的并且难以产生。其生产成本可为每克100到1000欧元。特别地，例如在体外哺乳动物细胞中大规模抗体生产需要在设备以及消耗品上的大量投资。此外，在生产治疗性抗体中特别重要的是产率和纯度。尽管在人健康方面，较高的成本在某种程度上是可接受的，但是治疗性抗体也可用于动物健康，在这种情况下这种成本可变得无法接受。为了开发用于大型动物的这样的治疗性抗体，有必要将生产成本降低至每克低于50欧元。近年来，通过产生能够产生重组抗体的转基因动物，出现了抗体生产的替代方法。特别地，重组抗体表达和这种抗体在哺乳动物(例如山羊)的乳中的分泌受到关注。尽管在产生转基因动物方面的投资是可观的，但是一旦获得了转基因动物，抗体的生产成本就会大大降低。然而，抗体的纯化仍然是一个重要的成本。此外，在产率和纯度上仍然存在明显的缺点。因此，本专利技术的一个目的是解决这些缺点中的一个或更多个。特别地，本专利技术的一个目的是提供从哺乳动物乳例如山羊乳中纯化(重组)抗体，特别是治疗性抗体的方法，同时满足市场的调节和经济需求，特别是以最小的成本和/或具有提高的纯度和/或提高的产率。
技术实现思路
在一方面中，本专利技术涉及用于分离和/或纯化抗体的方法，其包括：(a)提供包含异源抗体的羊(caprine)乳清，任选地脱脂羊乳清；(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。在另一方面中，本专利技术涉及用于分离和/或纯化抗体的方法，其包括：(a)提供包含异源抗体的羊乳，任选地脱脂羊乳；(b)从所述乳中去除酪蛋白以获得乳清；(c)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；(d)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及(e)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。在另一方面中，本专利技术涉及用于分离和/或纯化抗体的方法，其包括：(a)提供包含异源抗体的羊乳；(b)对所述乳进行脱脂；(c)从所述脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清；(d)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；(e)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及(f)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体。有利地，本专利技术的方法可包括用于纯化抗体的色谱法。在某些实施方案中，本专利技术的方法包括亲和色谱法。在某些实施方案中，该方法包括柱色谱法，例如柱亲和色谱法。在某些实施方案中，该方法包括填充床(柱)色谱法，例如填充床(柱)亲和色谱法。在某些实施方案中，本专利技术的方法包括连续色谱法，例如连续(填充床柱亲和)色谱法。在某些实施方案中，本专利技术的方法包括连续填充床(柱)色谱法。在某些实施方案中，对乳进行脱脂包括从所述乳中去除脂质。在某些实施方案中，对所述乳进行脱脂包括离心。在某些实施方案中，对所述乳进行脱脂包括对所述乳进行加热。在某些实施方案中，对所述乳进行脱脂包括在离心之前对所述乳进行加热。在某些实施方案中，对所述乳进行加热包括将所述乳加热至约30℃至约60℃的温度。已经发现对乳进行加热改善了脂肪去除，同时改善了随后的酪蛋白沉淀。在某些实施方案中，酪蛋白从所述(脱脂)乳中去除并且包括酪蛋白沉淀。在某些实施方案中，酪蛋白的去除和/或沉淀包括酸沉淀。在某些实施方案中，酪蛋白的去除和/或沉淀包括将pH调节至约3.5至约5.0的pH。在某些实施方案中，通过离心从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。在某些实施方案中，通过过滤从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。在某些实施方案中，通过离心和过滤从所述(脱脂)乳或(脱脂)乳清中去除酪蛋白。在某些实施方案中，对乳进行脱脂是在酪蛋白去除之前进行的。在某些实施方案中，酪蛋白去除在脱脂之前进行。在某些实施方案中，在使(脱脂)乳或(脱脂)乳清与含有蛋白A的基质接触之前，将乳/乳清和/或含有蛋白A的基质的pH调节至约5.0至8.0的pH。在某些实施方案中，异源抗体的洗脱包括将pH调节至约3.0至约5.0的pH。在某些实施方案中，异源抗体的洗脱包括将pH调节至约3.0至约4.5的pH。在某些实施方案中，在洗脱异源抗体之前，将(脱脂)乳或(脱脂)乳清和含有蛋白A的基质的pH调节至约4.5至约5.0的pH。在该pH水平下，已经发现残留的内源性羊抗体可从基质上洗脱下来，因此不会污染随后洗脱的异源抗体。在某些实施方案中，所述异源抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述异源抗体是重组抗体。在某些实施方案中，所述异源抗体在羊乳中转基因表达。在某些实施方案中，异源抗体不是羊抗体。在某些实施方案中，异源抗体是哺乳动物抗体。在某些实施方案中，异源抗体是鼠抗体、牛抗体、猪抗体、犬抗体、猫抗体、兔抗体、猴抗体、豚鼠抗体、大鼠抗体或马(包括驴和马)抗体。在某些实施方案中，异源抗体是IgG抗体。在某些实施方案中，异源抗体不是IgM或IgA抗体。在某些实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纯化抗体的方法，其包括：/n(a)提供包含异源抗体的羊乳清，任选地脱脂羊乳清；/n(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；/n(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及/n(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体；/n其中在洗脱所述异源抗体之前，内源性羊抗体被洗脱。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171114 EP 17201536.41.纯化抗体的方法，其包括：
(a)提供包含异源抗体的羊乳清，任选地脱脂羊乳清；
(b)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；
(c)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及
(d)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体；
其中在洗脱所述异源抗体之前，内源性羊抗体被洗脱。


2.根据权利要求1所述的方法，其包括：
(a)提供包含异源抗体的羊乳，任选地脱脂羊乳；
(b)从所述乳中去除酪蛋白以获得乳清；
(c)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；
(d)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及
(e)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体；
其中在洗脱所述异源抗体之前，内源性羊抗体被洗脱。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括：
(a)提供包含异源抗体的羊乳；
(b)对所述乳进行脱脂；
(c)从所述脱脂乳中去除酪蛋白以获得乳清；
(d)使所述乳清与含有蛋白A的基质接触；
(e)使所述含有蛋白A的固体基质与所述乳清分离；以及
(f)从所述含有蛋白A的固体基质中洗脱所述异源抗体；
其中在洗脱所述异源抗体之前，内源性羊抗体被洗脱。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述内源性羊抗体在低于用于洗脱所述异源抗体的pH的pH下洗脱；优选地，其中所述用于洗脱内源性羊抗体的pH为4.0至5.0，优选4.3至5.0，更优选4.5至5.0，例如pH为4.7或4.8。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷吉娜·弗雷切尔斯，奥利维耶·法夫尔比勒，弗朗索瓦·科特，贝特朗·梅罗，
申请(专利权)人：生物资源公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE