一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用技术

本发明专利技术提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。该荧光探针化学结构特征如下：荧光团母体是萘酰亚胺类染料，萘酰亚胺发色团母体连接取代基R，具体结构如式(1)所示。该小分子荧光探针在嘌呤基团的淬灭作用下荧光微弱，其能够专一性的识别SNAP标签蛋白并与其共价结合，结合后因嘌呤基团离去而荧光恢复。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而标记目标蛋白。由于标记前后荧光强度显著增强，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，该探针可以在体外免洗标记，也可以免洗标记活细胞内的任一蛋白质，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

A fluorescent probe for specific protein without washing and its synthesis and Application

【技术实现步骤摘要】
一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用
本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。
技术介绍
蛋白质的定点标记对于活细胞内蛋白质的定位与追踪具有重要的意义。通过小分子荧光探针标记蛋白来研究活细胞中蛋白质的位置、功能、以及蛋白-蛋白间通讯。目前常用的蛋白标及技术包括荧光蛋白融合法，单位点非天然氨基酸法，以及蛋白标签方法。荧光蛋白标记法存在蛋白尺寸较大、荧光相对稳定性差、且缺少近红外波段等缺点。非天然氨基酸的筛选过程复杂，耗时长，而且需要tRNA合成酶与改造的目标蛋白共表达，繁琐的改造与表达过程限制了非天然氨基酸技术的应用。相比之下，蛋白标签技术首先将标签蛋白与目标蛋白的融合表达，随后带有底物基团的荧光小分子通过与标签蛋白的专一性作用实现标记，该方法操作简单，可以选择任一荧光团作为母体，不但显示出荧光探针优越的光物理特性，而且对标记的位置与时间精准控制，被广泛的应用于目标蛋白的标记。目前常用的蛋白标签包括Halo，PYP，SNAP，BL等，其中SNAP标签是较常用的一个蛋白标签，他通过与O6-烷基鸟嘌呤衍生物的专一、共价连接而实现标记。各式的荧光小分子被设计出来用于快速、不可逆的蛋白标记，并且应用于药物监控、蛋白-蛋白相互作用、超分辨显微成像等。尽管如此，目前大多数用于SNAP标签蛋白的小分子探针在标记过程中需要清洗掉未反应的小分子后再成像观察。这一清洗过程时间冗长，不利于目标蛋白的实时观察与追踪，通常情况下，多数非特异性结合的小分子清洗不彻底导致信噪比高，影响观测。因此，与SNAP蛋白反应前后有荧光变化的小分子探针的设计就显得尤为重要。目前已经有一些免洗的SNAP荧光探针被设计出来，包括DRBG-488，CBG-549-QSY7等，但其结构复杂，合成过程繁琐。最近报道的BGSBD探针尽管结构简单，但是该荧光团的荧光性能较差，应用受限。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用该免洗标记特定蛋白质的荧光探针能够快速、专一、免洗的标记目标蛋白的小分子荧光探针，该探针可应用于体外检测或者活细胞内目标蛋白的生物成像。本专利技术所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，该探针分子结构式如下：其中：R为：(CH2)nCH3,(n＝0-4),苄基、吡啶亚甲基等。一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺。室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100:1-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺与脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为50-100:1mg/mL；脂肪伯胺包括N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺、N,N-二丙基乙二胺、N,N-二丁基乙二胺、N,N-二苄基乙二胺、N,N-二吡啶亚甲基乙二胺等；步骤(2)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾质量比为1:1-3:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为20-60:1mg/mL。一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，用于体外目标蛋白的免洗标记，或者细胞内特定蛋白的免洗标记。所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，所述的标记过程如下：(1)通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达；(2)该荧光探针通过与SNAP标签蛋白专一性共价连接实现对目标蛋白的标记。所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的的标记过程，其特征在于：荧光探针标记目标蛋白后不需要清洗，直接进行光谱检测或者荧光成像。本专利技术的优点和有益效果为：该小分子荧光探针在嘌呤基团的淬灭作用下荧光微弱，其专一性的识别SNAP标签蛋白并与其共价结合后，因嘌呤基团离去而荧光恢复。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而标记目标蛋白。由于标记前后荧光强度显著增强，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，附图说明图1实施例1制备的荧光探针BGAN-1核磁谱图氢谱；图2实施例1制备的荧光探针BGAN-1核磁谱图碳谱；图3为实施例3中描述的由实施例1制备的荧光探针BGAN-1(终浓度为2μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中与SNAP标签蛋白(4μM)作用前后的荧光光谱图。图4为实施例4中描述的将实施例1制备的荧光探针BGAN-1(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-Cox8和pSNAP-H2B质粒的Hela细胞后进行荧光共聚焦成像。图5为实施例5制备的荧光探针BGAN-2核磁谱图氢谱；图6为实施例5制备的荧光探针BGAN-2核磁谱图碳谱；图7为实施例6中描述的由实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中与SNAP标签蛋白(4μM)作用前后的荧光光谱图。图8为实施例7中描述的由实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-vector和pGFP-Tubulin质粒的Hela细胞后进行流式细胞仪检测的细胞数量图谱。图9为实施例8中描述的将实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-Cox8和pSNAP-H2B质粒的Hela细胞后进行荧光共聚焦成像。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，中间体BA-1的合成：将BA-Br(500mg,1.26mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二甲基乙二胺(250mg,2.84mmol)。反应液被缓慢加热至100℃,并在氮气保护下反应10h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：



其中R为：(CH2)nCH3,(n＝0-4),苄基或吡啶亚甲基。


2.根据权利要求1所述免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺，将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为10～100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。


3.根据权利要求2所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺与脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；N-(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21