一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种高稳定性的免洗SNAP‑tag探针及其制备方法和应用，该探针基于4,5‑位双取代萘酰亚胺染料，以苄基鸟嘌呤为靶向基团，其结构式如(1)所示。该探针的4,5‑位的氮杂环丁烷结构很大程度上抑制了TICT(扭转的分子内电荷转移)的产生，使萘酰亚胺分子保持高稳定性的同时对极性变得不敏感。该探针在能够在2分钟完成(t

A high stability and washless snap tag probe and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用
本专利技术属于荧光成像
，具体涉及一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用。
技术介绍
由于具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，有机小分子荧光染料在蛋白标记领域逐渐成为荧光蛋白的替代者。随着标签蛋白的出现，小分子荧光染料可以与融合有标签蛋白的目标蛋白发生专一的酶促共价连接反应，从而实现将小分子荧光染料特异性连接到目标蛋白。其中，应用最为广泛的标签蛋白为SNAP-tag，其能够与苄基鸟嘌呤(BG)与苄基氯嘧啶(CP)衍生物反应从而使SNAP-tag标记上人工合成的探针。随着超分辨荧光成像技术的迅速发展，单分子下监测蛋白功能的行使以及分布成为了生物、医学等研究工作者的重要方向。借助SNAP-tag标签法与有机小分子荧光染料可以达到纳米尺度对目标蛋白的实时监测，但是这对SNAP-tag探针的设计提出了苛刻要求。首先，荧光染料分子需要保持高的光稳定性，防止强激光的淬灭效应；其次，SNAP-tag与探针结合后需要达到免洗荧光成像，才能够实现实时对活细胞内目标蛋白监测。然而，目前的商业SNAP-tag探针多数基于罗丹明及花菁类染料，与SNAP-tag蛋白结合前后荧光变化小，且罗丹明及花菁染料容易在线粒体聚集导致无法实现免洗成像。此外，花菁染料光稳定性差，很难达到长时间实时成像。因此，高稳定性、免洗的SNAP-tag探针的设计对于蛋白功能的研究具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种高稳定的性免洗SNAP-tag探针，该系列探针与SNAP-tag蛋白结合后荧光增强8倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。本专利技术的另一目的是提供一种高稳定性免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法具有通用性，相比于目前嘌呤引入方法拥有步骤简单、易于提纯等优点。本专利技术提供一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针，以萘酰亚胺为荧光团，通过4,5-位四元环结构的调节使萘酰亚胺的荧光稳定性、亮度大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。本探针荧光发射波长不随极性变化而变化，能够保持所采集荧光信号的准确性。一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针具有如下结构：该探针基于4,5-位双取代萘酰亚胺染料，以苄基鸟嘌呤为靶向基团设计合成了，其结构式如(1)所示。该探针的4,5-位的氮杂环丁烷结构很大程度上抑制了TICT(扭转的分子内电荷转移)的产生，使萘酰亚胺分子保持高稳定性的同时对极性变得不敏感。该探针在能够在2分钟完成(t1/2＝8s)与与SNAP-tag的特异性结合，并在结合后实现8倍的荧光增强，实现了活细胞内对SNAP-tag的免洗荧光成像。一种高稳定的性免洗SNAP-tag探针的合成路线，如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺的合成：将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N(4-羟甲基)苄基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺；(3)SNAP-tag探针的合成：将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为2:1-8；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-100g/mL。步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺：氮杂环丁烷的质量比为1:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺：叔丁醇钾的质量比为5:4-20；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺：2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。上述一种免洗SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。本专利技术的SNAP-tag探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后达到off-on的效果，荧光增强8倍。该SNAP-tag探针分子由于4,5-位氮杂环丁烷对分子内扭转的限制使探针在结合SNAP-tag蛋白后荧光量子产率均大于0.40，亮度高、光稳定性好。该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后荧光波长及峰型不随极性变化而改变，能够保持荧光信号的准确性。该SNAP-tag探针能够对活细胞内SNAP-tag蛋白进行特异性识别，并实现免洗荧光成像。此外，探针可用于SIM，STED等超分辨荧光成像。附图说明图1为实施例1制备的BA-DAze的核磁谱图氢谱。图2为实施例1制备的SNAP-DAze的核磁谱图氢谱。图3为实施例1制备的探针SNAP-DAze的核磁谱图碳谱。图4为实施例1制备的探针SNAP-DAze在PBS中与1μMSNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。图5为实施例1制备的探针SNAP-DAze在PBS中与1μMSNAP-tag蛋白结合的动力学曲线图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。图6为实施例1制备的探针SNAP-DAze在转染pSNAPf-Cox8A的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。图7为实施例1制备的探针SNAP-DAze在转染pSNAPf-H2B的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：





2.根据权利要求1所述的一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针的制备方法，其特征在于该方法包含步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N(4-羟甲基)苄基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺；
(3)SNAP-tag探针的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21