用于靶向核酸编辑的基于CRISPR/CAS-腺嘌呤脱氨酶的组合物、系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了用于靶向和编辑核酸的系统、方法和组合物。特别地，本发明专利技术提供了非天然存在的或工程化的RNA靶向系统，所述系统包含靶向RNA的Cas13蛋白、至少一种指导分子和至少一种腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。

CRISPR / CAS adenine deaminase based composition, system and method for targeted nucleic acid editing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向核酸编辑的基于CRISPR/CAS-腺嘌呤脱氨酶的组合物、系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年6月26日提交的美国临时申请号62/525,181、2017年7月3日提交的美国临时申请号62/528,391、2017年7月18日提交的美国临时申请号62/534,016、2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,638、2017年10月4日提交的美国临时申请号62/568,304、2017年10月18日提交的美国临时申请号62/574,158、2017年11月27日提交的美国临时申请号62/591,187和2017年12月22日提交的美国临时申请号62/610,105的权益。以上确认的申请的全部内容特此以引用方式完全并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号MH100706、MH110049和HL141201在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。对以计算机可读格式共同归档的文档的引用于2017年7月3日创建的大小为891,043字节的名为“Clin_var_pathogenic_SNPS_TC.txt”的ASCII兼容文本文件经由EFS-WEB与本专利技术一同提交，该文件的内容特此以引用方式并入本文。专利
本专利技术总体上涉及用于靶向和编辑核酸，特别地用于目标靶基因座处腺嘌呤的可编程脱氨的系统、方法和组合物。
技术介绍
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术是通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的系统性逆向工程化成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用所需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活因子样效应子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homingmeganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要采用新颖的策略和分子机制且是负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程化技术。这将为基因组工程化和生物技术的新应用提供主要资源。先前已经报道了胞嘧啶的可编程脱氨，其可用于校正A→G和T→C点突变。例如，Komor等人,Nature(2016)533:420-424报道了在非靶向DNA链中通过APOBEC1胞嘧啶脱氨酶进行的胞嘧啶脱氨，Cas9-指导RNA复合物与靶向DNA链的结合导致该非靶向DNA移位，从而使得胞嘧啶转化为尿嘧啶。另参见Kim等人,NatureBiotechnology(2017)35:371-376；Shimatani等人,NatureBiotechnology(2017)doi:10.1038/nbt.3833；Zong等人,NatureBiotechnology(2017)doi:10.1038/nbt.3811；YangNatureCommunication(2016)doi:10.1038/ncomms13330。
技术实现思路
本申请涉及修饰目标靶RNA序列。使用RNA靶向而非DNA靶向可以提供与治疗发展相关的若干优势。首先，靶向RNA有很大的安全益处：由于转录组中的可用序列空间显著小于基因组，因此将存在较少的脱靶事件，并且如果脱靶事件确实发生，那么它将是短暂的且不太可能带来负面的副作用。其次，RNA靶向治疗剂将更加有效，原因是它们不受细胞类型的影响，并且不必进入细胞核，从而使它们更易于递送。本专利技术的至少第一方面涉及一种修饰目标靶RNA序列中的腺嘌呤的方法。在特定实施方案中，所述方法包括向所述靶RNA递送：(a)无催化活性的(死亡)Cas13蛋白；(b)指导分子，所述指导分子包含连接至正向重复序列的指导序列；和(c)腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域；其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域共价或非共价地连接至所述死亡Cas13蛋白或所述指导分子，或者适于在递送之后连接至所述死亡Cas13蛋白或所述指导分子；其中所述指导分子与所述死亡Cas13蛋白形成复合物并引导所述复合物结合所述目标靶RNA序列，其中所述指导序列能够与包含所述腺嘌呤的靶序列杂交以形成RNA双链体，其中所述指导序列在对应于所述腺嘌呤的位置处包含非配对胞嘧啶，导致在所形成的RNA双链体中出现A-C错配；其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域使所述RNA双链体中的所述腺嘌呤脱氨基。在某些示例性实施方案中，所述Cas13蛋白是Cas13a、Cas13b或Cas13c。所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域融合至所述死亡Cas13蛋白的N端或C端。在某些示例性实施方案中，所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域通过接头融合至所述死亡Cas13蛋白。所述接头可以是(GGGGS)3-11(SEQIDNo.1-9)GSG5(SEQIDNo.10)或LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR(SEQIDNo.11)。在某些示例性实施方案中，所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域连接至衔接蛋白，并且所述指导分子或所述死亡Cas13蛋白包含能够与所述衔接蛋白结合的适体序列。所述衔接序列可以选自MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、7s和PRR1。在某些示例性实施方案中，所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域插入到死亡Cas13蛋白的内环中。在某些示例性实施方案中，所述Cas13a蛋白在源自韦德纤毛菌(Leptotrichiawadei)的Cas13a蛋白的两个HEPN结构域中，特别是在位置R474和R1046处，或在Cas13a直系同源物中的其相应氨基酸位置处包含一个或多个突变。在某些示例性实施方案中，所述Cas13蛋白是Cas13b蛋白，并且所述Cas13b在源自动物溃疡伯格菌(Bergeyellazoohelcum)ATCC43767的Cas13b蛋白的位置R116、H121、R1177、H1182中的一个或多个位置中，或在Cas13b直系同源物中的其相应氨基酸位置中包含突变。在某些其他示例性实施方案中，所述突变是源自动物溃疡伯格菌ATCC43767的Cas13b蛋白的R116A、H121A、R1177A、H1182A中的一者或多者，或Cas13b直系同源物的其相应氨基酸位置中的突变。在某些示例性实施方案中，所述指导序列具有能够与所述靶序列形成所述RNA双链体的约29-53nt的长度。在某些其他示例性实施方案中，所述指导序列具有能够与所述靶序列形成所述RNA双链体的约40-50nt的长度。在某些示例性实施方案中，所述非配对C与所述指导序列的5’端之间的距离为20-30个核苷酸。在某些示例性实施方案中，所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域是人类、头足类动物或果蝇腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定点碱基编辑的工程化组合物，所述工程化组合物包含靶向结构域和腺苷脱氨酶或其催化结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170626 US 62/525,181;20170703 US 62/528,391;20171.一种用于定点碱基编辑的工程化组合物，所述工程化组合物包含靶向结构域和腺苷脱氨酶或其催化结构域。


2.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶向结构域是寡核苷酸结合结构域。


3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述腺苷脱氨酶或其催化结构域包含一个或多个突变，相对于野生型，所述一个或多个突变提高了所述腺苷脱氨酶的活性或特异性。


4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述腺苷脱氨酶包含一个或多个突变，相对于野生型，所述一个或多个突变改变了所述腺苷脱氨酶的功能性，优选地是所述腺苷脱氨酶使胞苷脱氨基的能力。


5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向结构域是CRISPR系统，所述CRISPR系统包含CRISPR效应蛋白或其保留DNA和/或RNA结合能力的片段，和指导分子。


6.如权利要求5所述的组合物，其中所述CRISPR系统是无催化活性的。


7.如权利要求5或6所述的组合物，其中所述CRISPR系统包含RNA结合蛋白，优选地是Cas13，优选地是所述Cas13蛋白是Cas13a、Cas13b或Cas13c，优选地是其中所述Cas13是表1、表2、表3、表4或表6中任一项所列出的Cas13，或者是来自表1、表2、表3、表4或表6中任一项所列出的细菌种类，优选地是其中所述Cas13蛋白是普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b、咽喉卟啉单胞菌Cas13b或鸭疫里默氏杆菌Cas13b；优选地是普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b。


8.如权利要求5、6或7所述的组合物，其中所述指导分子包含指导序列，所述指导序列能够与包含腺嘌呤的靶RNA序列杂交以形成RNA双链体，其中所述指导序列在对应于所述腺嘌呤的位置处包含非配对胞嘧啶，导致在所形成的RNA双链体中出现A-C错配。


9.如权利要求7所述的组合物，其中所述Cas13蛋白是Cas13a蛋白，并且所述Cas13a在源自韦德纤毛菌的Cas13a蛋白的两个HEPN结构域中，特别是在位置R474和R1046处，或在Cas13a直系同源物的其相应氨基酸位置处包含一个或多个突变，或者其中所述Cas13蛋白是Cas13b蛋白，并且所述Cas13b在源自动物溃疡伯格菌ATCC43767的Cas13b蛋白的位置R116、H121、R1177、H1182中的一个或多个位置处包含突变，优选地是R116A、H121A、R1177A、H1182A，或在Cas13b直系同源物的其相应氨基酸位置处包含突变，或者其中所述Cas13蛋白是Cas13b蛋白，并且所述Cas13b在源自普雷沃氏菌属种P5-125的Cas13b蛋白的位置R128、H133、R1053、H1058中的一个或多个位置处，优选地是在位置H133和H1058处包含突变，优选地是H133A和H1058A，或在Cas13b直系同源物的其相应氨基酸位置处包含突变。


10.如权利要求7所述的组合物，其中所述Cas13，优选地是Cas13b，被截短，优选地是在C端被截短，优选地是其中所述Cas13是相应野生型Cas13的截短功能变体，任选地其中所述截短Cas13b由普雷沃氏菌属种P5-125Cas13b的nt1-984或Cas13b直系同源物或同系物的相应nt编码。


11.如权利要求7所述的组合物，其中所述Cas13是无催化活性的Cas13，优选地是Cas13b6。


12.如权利要求10所述的组合物，其中所述指导序列具有能够与所述靶序列形成所述RNA双链体的约20-53nt、优选25-53nt、更优选29-53nt或40-50nt的长度，并且/或者其中所述指导序列的所述非配对C与5'末端之间的距离是20-30个核苷酸。


13.如权利要求12所述的组合物，其中所述指导序列包含不止一个对应于所述靶RNA序列中的不同腺苷位点的错配，或者其中使用两种指导分子，每种指导分子均包含对应于所述靶RNA序列中的不同腺苷位点的错配。


14.如前述权利要求中任一项所述的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·张，J·戈滕贝格，D·B·T·科克斯，O·阿布达耶，S·坎南，
申请(专利权)人：博德研究所，麻省理工学院，哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：美国;US