一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用技术

本发明专利技术提供了一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用。具体涉及到：优化适于大肠杆菌系统表达的rhGH的基因、并构建入适宜的表达载体和菌株；rhGH发酵工艺开发；rhGH纯化工艺开发，尤其是针对周质蛋白的提取工艺优化。本发明专利技术提供的rhGH分泌表达体系可以有效地实现rhGH的分泌，并且信号肽切除彻底。产出的rhGH具有良好的生理活性，工艺且具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点，并且提供的周质蛋白提取方法重复性良好，提取效率高，选择性良好。纯化后的样品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准。

A recombinant human growth hormone and its preparation and drug application

【技术实现步骤摘要】
一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
本专利技术属于基因工程、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用。
技术介绍
人生长激素(HumanGrowthHormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。含有191个氨基酸残基，分子量为22kDa左右，分子中无糖基化。人生长激素具有广泛的生理功能，几乎能影响所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。人生长激素(hGH)在人体生长发育过程中起着重要作用，能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。hGH原来仅用于生长激素缺乏儿童矮小症，后因基因工程产品问世，临床用量足以保证，随后又将适应症范围扩大到成人生长激素缺乏、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。生长激素的种族特异性很强，动物的生长激素人类是不能应用的，只有人类自身的生长激素才具有临床治疗功能。因此过去临床应用只能从人脑垂体提取，来源十分有限，价格也非常昂贵。到了上世纪70年代后期随着分子生物学的发展，特别是基因工程技术的发展，使得利用基因工程手段大规模生产重组人生长激素成为现实。应用DNA重组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径:一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。>一般胞内型重组人生长激素表达后定位在大肠杆菌基因工程菌的细胞质中，具有很高的产量，但是以无活性的包涵体形式存在，技术上可以通过包涵体复性的方法制备获得具有生理活性的rhGH，目前已经建立起比较完备的包涵体复性技术。但是由于大肠杆菌自身表达的特点，胞内型rhGH的N端相比较天然hGH在一级结构上多出一个甲硫氨酸，并且复性后无法通过体外切割的手段去除该氨基酸。已有研究表明甲硫氨酸的存在可以诱导胞内型rhGH的抗体产生，进而影响药效。分泌型rhGH的表达是通过在rhGH基因序列的N端加入信号肽的基因，表达后首先在大肠杆菌胞质中形成可溶的信号肽-rhGH的融合蛋白，然后信号肽引导融合蛋白进入大肠杆菌周质空间，在周质空间中由蛋白酶切除信号肽而获得与天然hGH一级结构完全一致的rhGH，并且周质空间中的内环境可以介导形成完整活性的rhGH。但是大肠杆菌周质空间比较有限，并且分泌效率一般不高，因此分泌型rhGH的产量一般不高。
技术实现思路
本专利技术旨在开发一种分泌型rhGH及其表达和纯化方法，要解决的主要技术问题是：1、优化和构建适于大肠杆菌表达的rhGH的基因、载体和菌株，以实现高效分泌表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rhGH大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发周质蛋白提取和分离纯化工艺，确立易于放大、成本低廉、工艺简单的纯化方法，制备高纯度、高生物活性的rhGH原蛋白。本专利技术首先提供一种针对大肠杆菌表达系统密码子优化后的重组人生长激素的基因序列，如SEQIDNO：1所示，并且在该序列前还有如SEQIDNO：2所示的OmpA3信号肽基因序列。所述重组人生长激素及OmpA3信号肽的氨基酸序列分别如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。本专利技术还提供一种用于携带和表达所述rhGH基因的表达载体，如pET、pDEST14载体等。本专利技术还提供一种用于所述rhGH重组表达质粒表达的大肠杆菌宿主，如BL21(DE3)、BL21AI等。本专利技术还提供一种表达rhGH大肠杆菌的发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到20左右时，开始进行补料培养；待菌体生长至0D600≈20-50之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的L(+)-阿拉伯糖进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，甘油20-40g/L，七水合硫酸镁1-4g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述补料培养基主要成分包括：甘油500g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，酵母粉30-50g，胰蛋白胨30-50g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/100(V/V)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O15g/L、MnSO4·5H2O5g/L、CaCl2·7H2O1g/L、CoCl·6H2O1g/L、Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO30.0625g/L、HCl41.75ml、Biotin0.5g/L。本专利技术通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-50％之间，具体来说就是，设定DO为30-45％之间，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.3-1VVM，然后通过逐渐提高转速以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在设定值时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。本专利技术通过自动补加氨水的方法用于控制pH稳定，氨水的添加可以用来调节pH同时也可以作为氮源被大肠杆菌利用。本专利技术还提供一种rhGH周质蛋白提取和粗纯方法，该方法可以有效地提取获得周质蛋白，并且很少将胞内蛋白提取出来。包括：发酵菌体-20℃冷冻24h以上→冷冻的菌体2-8℃低温解冻8h以上→解冻后菌体使用高渗缓冲液(20mMTrisHClpH8.0+20-30％蔗糖+1mMEDTA)重悬至100-150g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清1和菌体沉淀1→将菌体沉淀1再次使用低渗缓冲液(20mMTrisHCl+5mM硫酸镁+1mMEDTA)重悬至100g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清2。上清1和上清2合并，过滤去除不溶性杂质即获得周质蛋白提取液。将周质蛋白提取液使用切向流超滤系统浓缩至原体积的1/2至1/4，然后在搅拌混匀条件下向其中按250-280g/L(质量/初始体积)缓慢加入硫酸铵颗粒进行盐析，2-8℃静置1h，然后离心收集沉淀，沉淀即为粗纯的rhGH。使用复溶缓冲液(20mMTris+0.8M硫酸铵+1mMEDTA，pH7.5)按2L/kg(起始发酵菌体湿重)将rhGH盐析沉淀复溶，2-8℃复溶30min以上，最终过滤获得清液即为rhGH粗纯液。本专利技术还提供一种rhGH粗纯液的层析纯化方法，具体包括：将rhGH粗纯液使用PhenylFastFlow(Ph本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人生长激素，其特征在于，其由如SEQ ID NO：1所示的基因序列在大肠杆菌表达系统中分泌表达得到，且所述基因序列前还有如SEQ ID NO：2所示的OmpA3信号肽基因序列。/n

【技术特征摘要】
20181212 CN 20181151481561.重组人生长激素，其特征在于，其由如SEQIDNO：1所示的基因序列在大肠杆菌表达系统中分泌表达得到，且所述基因序列前还有如SEQIDNO：2所示的OmpA3信号肽基因序列。


2.用于携带和表达权利要求1所述重组人生长激素编码基因的表达质粒。


3.根据权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述质粒为pDEST14。


4.含有权利要求3所述表达质粒的大肠杆菌。


5.根据权利要求4所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21AI。


6.权利要求1所述重组人生长激素的大肠杆菌发酵表达方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求5所述大肠杆菌发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵，所述的发酵包括如下步骤：
将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到20左右时，开始进行补料培养；
待菌体生长至0D600≈20-50之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的L(+)-阿拉伯糖进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。


7.权利要求1所述重组人生长激素的蛋白提取和粗纯方法，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵百学，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32