钩状探针、核酸连接方法以及测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种钩状探针、核酸连接方法以及测序文库的构建方法，所述钩状探针包括目标特定区域和相连的钩区域，所述目标特定区域包括与待连接的核酸片段的至少部分单链互补配对的序列，所述钩区域包括与所述核酸片段不配对的序列，所述钩区域的末端是可连接末端，所述可连接末端能够连接到所述核酸片段的单链末端。

Hook probe, nucleic acid connection and construction of sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】钩状探针、核酸连接方法以及测序文库的构建方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种钩状探针、核酸连接方法以及测序文库的构建方法。
技术介绍
高通量测序技术是对传统测序的一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，以对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析，以发现与表型相关的基因或基因变异位点，为科研和应用提供理论基础。高通量测序文库是通过一系列生化反应，将已知人工合成序列加入片段化的DNA或RNA中形成的可以被扩增放大的DNA或cDNA序列片段集。加上的已知人工合成序列通常称为接头，主要起到扩增文库和提供测序引物杂交互补序列的作用。文库构建的基本流程概括包括核酸提取、核酸片段化(若为游离DNA，则无需片段化)、片段化核酸末端修复及修饰、接头连接、片段扩增或无需扩增这几步。根据不同的研究目的及不同的起始样本类型，文库构建的流程在上述基本流程基础上略有不同，如游离DNA的建库无需再打断DNA，RNA的建库需要做反转录成cDNA的额外处理，目标区域的建库需要采用杂交或扩增的方法从DNA或RNA中富集出目标区域序列等。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种钩状探针，其特征在于，所述钩状探针包括目标特定区域和相连的钩区域，所述目标特定区域包括与待连接的核酸片段的至少部分单链互补配对的序列，所述钩区域包括与所述核酸片段不配对的序列，所述钩区域的末端是可连接末端，所述可连接末端能够连接到所述核酸片段的单链末端。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种钩状探针，其特征在于，所述钩状探针包括目标特定区域和相连的钩区域，所述目标特定区域包括与待连接的核酸片段的至少部分单链互补配对的序列，所述钩区域包括与所述核酸片段不配对的序列，所述钩区域的末端是可连接末端，所述可连接末端能够连接到所述核酸片段的单链末端。


根据权利要求1所述的钩状探针，其特征在于，所述待连接的核酸片段是包括目标区域的靶核酸，所述目标区域是待富集的核酸区域。


根据权利要求2所述的钩状探针，其特征在于，所述目标特定区域包括与所述靶核酸的靶位点侧翼位置和/或靶位点内的序列、或与靶位点连锁的位点侧翼位置和/或与靶位点连锁的位点内的序列互补配对的序列。


根据权利要求1所述的钩状探针，其特征在于，所述钩区域包括通用引物结合位点；
任选的，所述的钩区域还包括唯一分子标签序列和/或样本标签序列。


根据权利要求1所述的钩状探针，其特征在于，所述钩状探针是5'钩状探针，所述5'钩状探针具有结构5'-(目标特定区域)-(钩区域)-3'，所述钩区域3'末端具有能够连接到所述核酸片段的5'末端的功能性3'羟基基团。


根据权利要求5所述的钩状探针，其特征在于，所述5'钩状探针的5'末端具有可阻断其与其它单链或自身单链发生连接反应的5'封闭基团。


根据权利要求5或6所述的钩状探针，其特征在于，所述5'钩状探针的钩区域包括唯一分子标签和/或样本标签、通用引物结合位点，所述5'钩状探针具有结构5'-(目标特定区域)-(唯一分子标签和/或样本标签)-(通用引物结合位点)-3'。


根据权利要求1所述的钩状探针，其特征在于，所述钩状探针是3'钩状探针，所述3'钩状探针具有结构5'-(钩区域)-(目标特定区域)-3'，所述钩区域5'末端具有能够连接到所述核酸片段的3'末端的功能性5'磷酸基团。


根据权利要求8所述的钩状探针，其特征在于，所述3'钩状探针的3'末端具有可阻断其与其它单链或自身单链发生连接反应的3'封闭基团。


根据权利要求8或9所述的钩状探针，其特征在于，所述3'钩状探针的钩区域包括通用引物结合位点、唯一分子标签和/或样本标签，所述3'钩状探针具有结构5'-(通用引物结合位点)-(唯一分子标签和/或样本标签)-(目标特定区域)-3'。


根据权利要求1所述的钩状探针，其特征在于，所述钩区域包括酶切位点；
优先的，所述的酶切位点为限制酶识别结合位点和/或能被切割的一个或多个修饰的核苷酸。


一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-11任一项所述的钩状探针，任选地，还包括至少一种连接酶，所述连接酶用于将所述钩状探针的可连接末端与待连接的核酸片段的末端连接。


权利要求1-11任一项所述的钩状探针在构建核酸测序文库中的用途；
优选地，所述核酸测序文库是高通量测序文库。


一种核酸连接方法，其特征在于，所述方法包括：
使权利要求1-11任一项所述的钩状探针与变性的待连接的核酸片段退火杂交；以及
在连接酶的存在下，使所述钩状探针的可连接末端与所述核酸片段的单链末端连接。


一种核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
使权利要求1-11任一项所述的钩状探针与变性的待连接的核酸片段退火杂交的步骤；和
在连接酶的存在下，使所述钩状探针的可连接末端与所述核酸片段的单链末端连接的步骤。


根据权利要求15所述的核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法还包括：
去除线性非特异性连接产物、多余的核酸片段以及多余的钩状探针的步骤；

优选地，使用单链外切酶消化所述线性非特异性连接产物、多余的核酸片段以及多余的钩状探针。


根据权利要求15或16所述的核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法还包括：
使用通用引物对所述钩状探针和所述核酸片段的连接产物进行PCR扩增的步骤。


根据权利要求15或16所述的核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述钩区域包括可用限制酶切割的限制酶结合位点和/或能被切割的一个或多个修饰的核苷酸，所述方法还包括：
使用限制酶对所述限制酶结合位点进行限制性酶切和/或使用切割酶对所述一个或多个修饰的核苷酸进行切割的步骤。


根据权利要求15所述的核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述钩状探针包括5'钩状探针和3'钩状探针，所述5'钩状探针的钩区域3'末端具有能够连接到所述核酸片段的5'末端的功能性3'羟基基团；所述3'钩状探针的钩区域5'末端具有能够连接到所述核酸片段的3'末端的功能性5'磷酸基团；所述5'钩状探针的钩区域和所述3'钩状探针的钩区域分别包括通用引物结合位点；所述方法具体包括如下步骤：
使所述钩状探针与变性的待连接的核酸片段退火杂交；
在连接酶的存在下，使所述5'钩状探针的功能性3'羟基基团与所述核酸片段的5'末端连接，使所述3'钩状探针的功能性5'磷酸基团与所述核酸片段的3'末端连接；
使用单链外切酶消化所述线性非特异性连接产物、多余的核酸片段以及多余的钩状探针；和
使用通用引物对所述钩状探针和所述核酸片段的连接产物进行PCR扩增，其中所述通用引物分别与所述5'钩状探针和所述3'钩状探针的通用引物结合位点互补配对。


根据权利要求15所述的核酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述钩状探针包括5'钩状探针和3'钩状探针，所述5'钩状探针的钩区域3'末端具有能够连接到所述核酸片段的5'末端的功能性3'羟基基团；所述3'钩状探针的钩区域5'末端具有能够连接到所述核酸片段的3'末端的功能性5'磷酸基团；所述5'钩状探针的钩区域和所述3'钩状探针的钩区域分别包括可用限制酶切割的限制...

【专利技术属性】
技术研发人员：江媛，席阳，章文蔚，刘鹏娟，赵霞，李巧玲，沈寒婕，张永卫，拉多杰·德马纳克，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44