一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种氮高效转基因大豆SA‑4外源插入片段的侧翼序列及其应用，属于基因育种技术领域。本发明专利技术提供的氮高效转基因大豆事件SA‑4经鉴定插入位点侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明专利技术提供了用于检测该旁支序列的引物，如SEQ ID No.3～6所示。本发明专利技术提供的侧翼序列及其鉴定适用于氮高效转基因大豆SA‑4(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

Flanking sequence, acquisition method and application of a nitrogen efficient transgenic soybean sa-4 exogenous insert

【技术实现步骤摘要】
一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用
本专利技术属于基因育种
，尤其涉及一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用。
技术介绍
转基因育种具有性状改良精准、周期短等特点。利用转基因技术进行作物氮素利用效率改良可以改善氮肥过度施用的现状，提高农业的可持续发展能力。自噬在氮素充分与氮素不足条件下都是植物体进行氮素再动员的主要形式(Guiboileau等，2012)。自噬也是叶片衰老过程中营养物质再动员和早期转运的主要形式之一。在拟南芥中证明很多自噬相关基因ATGs的突变都会导致植物早衰，表现出对氮/碳胁迫更为敏感的表型((Doelling等，2002；Hanaoka等，2002；Yoshimoto等，2004；Thompson等，2005；Xiong等，2005；Chung等，2010)。GmATG8c蛋白是细胞自噬关键蛋白，在自噬体的形成和延展过程中发挥重要的功能(XiaT,XiaoD,LiuD,ChaiW,GongQ,etal.HeterologousexpressionofATG8cfromsoybeanconferstolerancetonitrogendeficiencyandincreasesyieldinArabidopsis.PLoSONE,2012,7:e37217.doi:10.1371)。大豆个体发育过程中，伴随着种子的生长，叶片与营养体迅速衰老死亡(LindooSJ,NoodenLD.Theinterrelationoffruitdevelopmentandleafsenescencein“noka”soybeans.BotGaz(Chicago),1976,137:218-223)，称为单次结实性衰老(monocarpicsenescence)。这一发育特点导致在大豆种子发育过程中，“源”叶中的营养物质不能得到充分的动员与外运。此外，多种逆境都会造成大豆叶片衰老和产量变化。有实验证明，减缓种子发育过程中植株的衰老可以有效地促进大豆座荚率和胚珠发育、提高大豆的品质和产量(MosjidisCO'H,PetersonCM,TrueloveB,DuteRR.Stimulationofpodandovulegrowthofsoybean,Glycinemax(L.)Merr.,by6-Benzylaminopurine.AnnBot,1993,71:193-199；NoodenLD,LethamDS(1993).Cytokininmetabolismandsignalinginthesoybeanplant.AustJPlantPhysiol,1993,20:639-653)。有研究发现，携带重组基因GGd1d1d2d2的大豆，其叶片衰老被明显延缓，种子产量大幅度提高(GuiboileauA,YoshimotoK,SoulayF,BatailléMP,AviceJC,Masclaux-DaubresseC.Autophagymachinerycontrolsnitrogenremobilizationatthewhole-plantlevelunderbothlimitingandamplenitrateconditionsinArabidopsis.NewPhytol,2012,194(3):732-740)。为特异性增强种子发育过程中“源”器官的营养动员效率，申请人利用衰老特异性启动子GmSARK(XuF,MengT,LiPL,YuYQ,CuiYJ,WangYX,GongQ,WangNN.ASoybeanDual-SpecificityKinase,GmSARK,andItsArabidopsisHomolog,AtSARK,RegulateLeafSenescencethroughSynergisticActionsofAuxinandEthylene.PlantPhysiology,2011,157:2131-2153)构建GmSARK:GmATG8c融合基因，将携带GmSARK:GmATG8c融合基因的植物表达载体通过农杆菌介导法转入到大豆基因组中，获得了一个氮高效转基因大豆事件SA-4，并正在进行中间试验阶段的安全评价。对转基因大豆进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因大豆进行监管管理，而外源插入片段的侧翼序列，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因大豆SA-4的侧翼序列，但是现有技术中并未报道有转基因大豆SA-4的侧翼序列。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用，本专利技术提供的侧翼序列可应用于转基因大豆的检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述的侧翼序列的获取方法，包括以下步骤：1)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，将所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆SA-4的T-DNA序列插入到大豆基因组第16号染色体的30500320～30500792碱基之间；2)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。优选的，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3～6所示，所述SEQIDNo.3～4为扩增SEQIDNo.1的引物，所述SEQIDNo.5～6为扩增SEQIDNo.2的引物。优选的，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。优选的，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA100ng，10×buffer2.5μl，2.5mMdNTPs2μl，10μM引物各1μl，5U/μlTaq酶0.2μl，ddH2O补至25μl。本专利技术通过基因组重测序结合基因组PCR的方法获得了高氮素利用转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。根据获得上述侧翼序列的引物，可以检测该侧翼序列，进而建立针对氮高效转基因大豆SA-4事件的鉴定方法，通过普通PCR扩增得到了包含载体片段又包含大豆基因组信息的序列，本专利技术提供的侧翼序列和引物适用于对转基因大豆SA-4(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其他制品)的检测。附图说明图1为载体构建示意图；图2为氮高效转基因大豆SA-4的T4代植株的PCR检测，其中M，GenStarD2000plusDNAmarker；TL，受体大豆天隆一号阴性对照；1-4，4株转基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。


2.权利要求1所述的侧翼序列的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，将所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆SA-4的T-DNA序列插入到大豆基因组第16号染色体的30500320～30500792碱基之间；
1)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果与phytozome数据库中的大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行比对，得到侧翼序列。


3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁宁，王丹，靳洁莉，刘生，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12