一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒，其特征在于：１）第一次ＰＣＲ反应液体系：ＰＣＲ反应缓冲液２２．５μｌ、引物Ｆ２０．５μｌ、引物Ｒ２０．５μｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μｌ；２）第二次ＰＣＲ反应液体系：ＰＣＲ反应缓冲液２２．５μｌ、 引物Ｆ３０．５μｌ、引物Ｒ３０．５μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μｌ；其中，第一次ＰＣＲ反应引物为：Ｆ２：５’－ＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡ－３’；Ｒ２：５’－ＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴ－３’；第二次ＰＣ Ｒ反应引物为：Ｆ３：５’－ＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡ－３’；Ｒ３：５’－ＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＴＧＣ－３’；第一次ＰＣＲ和第二次ＰＣＲ反应液体系中ＰＣＲ反应缓冲液含有：１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣＩ，ｐＨ８ ．３；５０ｍＭ ＫＣＩ、１．５ｍＭ ＭｇＣＩ２、ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ；３）阳性对照ＤＮＡ １μｌ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因作物，具体的说是 一种适用于饲料的转基因大豆检测 方法及检测试剂盒。
技术介绍
转基因作物是指利用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代，也称为遗传修饰生物体 (Genetically modified organisms, GM0s )。自1983年首例转基因植物问世以来，全球转基因作物的种植面积和销售收入均以倍数增长。但从严 肃的科学意义上说，转基因农产品的生物安全性目前尚无确定的结论。人 类关注转基因食品安全的同时，也关注着动物伺料的安全。甸料安全是食 品安全的一个重要环节，转基因饲料的安全性检测也将为相应转基因食品 的安全性提供有力的证据。我国的饲料生产已经具有相当规模，饲料中常 用的原料有大豆、豆粕、棉籽粕、玉米菜籽粕等，这些可能含有转基因的 作物有对动物、人体和生态环境存在不可知的危害。到目前为止，尚未见 关于对飼料进行转基因检测的专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高度灵敏性的适用于饲料的转基因大 豆检测方法及检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术釆用的技术方案为 试剂盒1) 第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22. 5nil、引物F20.5]al、 引物R2 0. 5ju 1, Taq DNA聚合酶0. 5 ji 1;2) 第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22. 5jal、引物F30.5jul、 引物R3 0. 5|al、 Taq DNA聚合酶0. 5 ja 1;其中，第一次PCR反应引物为F2: 5， "CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3， ； R2: 5， ~<XGGAAAGGCCAGAGGATT-3，； 第二次PCR反应引物为F3: 5， -TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3， ； R3: 5，《AGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3，； 第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mM Tris-HCI， pH8. 3; 50mM KCI、 1. 5mM MgCI2、 d證0. 2mM;3) 阳性对照顧A 1 ju 1。 所述阳性对照DNA为转基因大豆DNA。检测方法1 )提取模板DNA:称取l-10g转基因大豆的原料，加入10-100ml预冷的提取缓冲液混匀； 加入预热60-7(TC的裂解缓冲液混匀；60-7(TC温育30-60min;冷却后加入 5-50ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混勾，室温放置3-10分钟；而后在 10000-13000rpm离心8-15min,取上清液并在上清液中加入5-50ml酴和氯 仿混合液混匀，室温放置3-IO分钟；再以10000-13000rpm离心8-15min 取上清液；上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇，-20--4(TC放置 20-30min, 10000-13000rpm离心10-15min,即得到提取模板DNA,待用；2)进行转基因检测步骤l)得到的DNA模板液取lnl加入PCR反应缓冲液，并加入引物 F2和R2各0. 5jil以及TaqDNA聚合酶O. 5|il,混合均匀，而后在94。C预 变性2min, 94。C变性30s, 55。C退火30s, 72。C延伸45s,共35个循环， 最后72。C延伸10min;得到第一次PCR扩增产物，取1 ji 1第一次PCR扩增 产物加入无菌双蒸水进行50-100倍稀释，而后取1 ju 1稀释液加入PCR反 应液缓冲液中，并加入引物F3和3各0. 5 ia 1以及TaqDNA聚合酶0. 5 ji 1, 混合均句，以上述PCR反应条件进行第二轮扩增，得到扩增产物；F2: 5， "CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3， ； R2: 5， ~CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3，； F3: 5， -TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3， ； R3: 5， ~CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3，； 将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳和紫外光检测结果，如果存在250bp 的DNA条带，证明所检测的原料中含有转基因大豆。所述步骤1 )中提取的模板顧A沉淀在体积浓度为70%乙醇中洗涤l-2 次，晾干后，溶于500-1000]il双蒸水中，待用。所述步骤l)中异戊醇、 乙醇和氯仿的体积比为4: 20: 76;酚和氯仿体积比为1: 1;提取缓冲液为0. 8M NaCI; 5函Tris-CI， l隨EDTA; pH8. 0;裂解缓冲液为0. 8M NaCI; 50M Tris-CI, 10mM EDTA; 20% CTAB; pH8. 0。所述预冷的异丙醇预冷温度为4 。C。本专利技术所具有的有点本专利技术通过针对各种畜禽和水产饲料建立了具有高度灵敏性的转基因 检测技术，并且提取高质量的DNA和釆用高灵敏度的检测技术对其外源基 因进行检测。本专利技术克服配合词料中添加的转基因豆粕DNA为受到严重破坏的DNA 的缺点，豆粕为转基因大豆生产豆油过程中产生的副产品，其基因组DNA 在压榨的过程中产生了剧烈的破坏，伺料加工过程中粉碎、制粒和熟化等 高温、高剪切力等问题，也进一步破坏了其基因组DNA,由此得到转基因饲 料中外源基因的检测具有更高的难度，并通过本专利技术试剂盒可提取高质量 的DNA和釆用高灵敏度的检测技术对其外源基因进行检测。本专利技术釆用CTAB法提取配合饲料的基因组总DNA，并且根据GenBank 中登录的转基因大豆外源基因序列设计了 2对引物，釆用这两对引物对含有2%, 5%， 20%, 30%, 50%含量的转基因豆粕的饲料进行进行巢式PCR 检测，结果显示能成功检出其中的转基因成分。利用本专利技术对巿售35份饲 料中有32份检出了转基因大豆的特异外源基因序列，发现其中91%的饲料 釆用了转基因豆粕。本专利技术具有很高的灵敏度。 附图说明图1为本专利技术饲料中的DNA电泳图谱。图2为本专利技术同豆粕含量的对虾饲料的巢式PCR扩增结果的电泳图谱， 其中根据M为，DL2000分子量标准；l为，阴性对照(非转基因饲料)； 2-7,不同豆粕含量的对虫下饲料(重量百分比分别为50%, 30%, 20%， 5 %, 2%, 0%); 8为，阳性对照DNA (转基因大豆)具体实施例方式下面进一步详细叙述本专利技术。实施例1适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒1) 第一次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22. 5nl，引物F2和R2(各 0.5 ml), Taq DNA聚合酶0. 5 ju 1。2) 第二次PCR反应液体系PCR反应缓冲液22. 5yl，引物F3和R3(各 0. 5|al), Taq dna聚合酶0. 5)j1。其中，第一次PCR反应引物为F2: 5, "CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3，； R2: 5， ~CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3，； 第二次PCR反应引物为F3: 5， -TAACMCATGGCACAAGGGATACA-3， ； R3: 5， ~CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3，； 第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有10mM Tris-HCI,p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒，其特征在于：１）第一次ＰＣＲ反应液体系：ＰＣＲ反应缓冲液２２．５μｌ、引物Ｆ２０．５μｌ、引物Ｒ２０．５μｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μｌ；２）第二次ＰＣＲ反应液体系：ＰＣＲ反应缓冲液２２．５μｌ、引物Ｆ３０．５μｌ、引物Ｒ３０．５μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μｌ；其中，第一次ＰＣＲ反应引物为：Ｆ２：５’－ＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡ－３’；Ｒ２：５’－ＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴ－３’；第二次ＰＣＲ反应引物为：Ｆ３：５’－ＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡ－３’；Ｒ３：５’－ＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＴＧＣ－３’；第一次ＰＣＲ和第二次ＰＣＲ反应液体系中ＰＣＲ反应缓冲液含有：１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣＩ，ｐＨ８．３；５０ｍＭ ＫＣＩ、１．５ｍＭ ＭｇＣＩ２、ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ；３）阳性对照ＤＮＡ １μｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘梅，王雷，陶冉，王宝杰，蒋克勇，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95
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