本发明专利技术涉及一种微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：环介导等温扩增反应扩增品系为ＧＴＳ４０－３－２的转基因大豆外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ得到扩增反应物－待测外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ的双链目标序列，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化铅对来源于外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，进而达到对检测转基因大豆外源基因（ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ）的电化学检测的目的。本发明专利技术优点是快速、特异性强、灵敏度高而且使用方便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因鹏检测施，具糊用环介导纖广增(LAMP)技术与纳米硫化铅标己基因序列电化学分析S^ffl检测转基因^^卜M因(CP4EPSPS) 6<]^法~~l:孑Lfe固定与纳米硫化铅硫电化雜测转基因烦的方法。技术背景蹄来，转基因植鹏絲的榊直面积3ffiS增长，主导的转基因旭^^^ 因作物的63%以 上，所有的转基因烦均为Sm草剂旭，mf^t^甘l^基因旭。该品系烦的外源蛋白为CP4 EPSPS,可以有效的,除草齐瞎甘膦，而经动物实飽正实对人畜无害。在中国的转基因检测的国家标 准中，确^ffi^测CP4EPSPS基因列为筛;^因。fM^现有^^测方法都^S于鄉拥fi^的PCR或 者荧光PCRfe^的，没有4顿环介导^a扩增技^^测CP4EPSPS基因的，也没剤拂环介导^^" 增狱与纳斜射己电化学分析^^OT检测CP4EPSPS基因附艮导。现有的方法雜检测赫高、耗时 长纖点。
技术实现思路
本专利技术的目的^M^纳米硫化铅标d^W^^列微 UK^交电化学分析与环介导^M扩增糊检测转基因，HiS因cP4EPSPS的方S^孑版固定与纳米硫化铅禾射己电化^^测转基因m以划艮现有S7lt的Jd^缺点，从而为转基因产品的检测M^，行的方法。本专利技术的錢原鹏(1) ^^设it"^且可以i湖鹏DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引 物和下游内弓嫩)和两个外弓鹏(上微卜引物和下微卜弓卿)，内引t^含耙DNA的JEX链和反义紘(2)其中一个内引牧虔先和耙DNA杂交，te的MB换DNA合^具有高度,换活性的DNA聚 娜的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA,荆乍为由杂效U耙的另一端的—内引物和一个外 引物启动的DNA合礙鎌，产生一个原始的新DNA; (3)内弓物以原始執DNAf^fc启繊 置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一，的由两倍茎M的，DNA; (4)在^^劍牛 下，内引物以莲环DNA为禾莫板，fflam^^成多^^WlGDNASfiJ^列的，DNA，在一小时内 该循环^^ f鞭DNA累积Slj 10^拷贝。LAMP^r增的J^t^微孑Lfei:固定后与纳米硫化铅feia的 徽序列姓舒杂^aS而结合，利用鹏躲效链DNA掘微子溶解后翻高灵敏的电化学 分t^^测定溶解的^a离子，产生的电化学分析信号与LAMP^T增 ^tl相关，进而超0^^测转 基因±^卜源基因(CP4EPSPS)的电化^1i测的目的。本专利技术涉及的环介导^r增翻检测转基因旭，扩增飄在棘乙纖 版固定，纳米硫化铅标B^雜,列电化学分析lW^法，其中的淑l泡括如下(1) - (4): (1)环介导織广增(LAMP)鹏瓶 包括lOxThomopd鹏缓冲液、300—500Mmol/LdNTP、 2—4mmol/L硫,、0.8—1.2pmol上游内 弓胸、0.8—1.2nmol/L下游内弓嫩、0.2-03nmo]/L上黻卜弓胸、0_2—0.3Mmol/L下微卜弓胸和1—1.5 mol/L 甜魏；1U/mLUNG酷；其中10xltemopoiaSM冲液含有200mmol/LpH8.8的三P強甲基錢甲烷 —盐酸、100 mmol/L氯化钾、100mmol/L硫^^、 20 mmo!/L硫lg^和1 %曲繊X—100;其中，上游内弓嫩5-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3、 下游内引物5-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3、 上微卜弓胸5"CCATGGGCGCCAGGAT-3 、 下微卜引物5-ATCGGGCGCnTGTGAG-3;(2) BstDNA聚鲷8U4iL; 上面M^环介导^S扩增SiS液每管23iiL的最^a^为2.5jiL 10xTheimopol^iM爰冲液、l.O^LlOmmol/LdNTP (四种脱ftf亥塘核酸的混溯)、1.0pL20Mmol/L上游内弓胸(FIP)、 1.0nL20nmol/L下 游内引物(BIP)、 0.25ML20^imol/L上微卜引物(F3)、 0.25nL20Mmol/L下微卜引物(B3)、 0.5|4L 100mmol/L MgS04、 12.5pL2MSW^4pLddH20 (灭菌双蒸冰)。(3) 转基因掛卜源基因CP4EPSPS^f序列的纳米硫化铅(PbS) —^f十序歹!fei己液，其帝恪 施如下将8.(M3.0 mL M乙,口到50.0 mL浓度为0.2-0.5 mmol/L的Pb(NQ3)2溶液中混合均匀，用0.44).6 md/L NaOH溶液调节混合液的pH值约为7，通氮气線20^ 45min后，在勸^^禾nE气微下向上 述混合液中缓厦滴加1.2-1.6 mmol/L的Na2S溶液30.0 mL。滴加完毕后，^l#2( 0h，混合^m 地 ^色，即得到纳米PbS溶胶。取5.0mL纳米PbS溶M心纯化，水te分散于2,0mL水中，加 入100nL40.歸.0mmol/L乙教3-二甲基氨^)^二3El^fc^fe (EDC)、 100 40.0~60.0 mmol/L N-，5MJ6SBa安(NHS)及0.1mmol/LssDNA^f序列(5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3')，室温下 15-20 h， i^S/S鹏10000 r/minT^心2040 min，用PBS溶液洗涤多次，再分散于PBS溶液中，f穀廿 含有硫徽序列的纳米PbS-徽序列硫液，于-2 下保存。^fflJJ^溶液检测扩增品系为GTS 4(W-2的转基因，卜源基因CP4 EPSPS，依次包括下列步骤(l) -(4):(1) 待检样品DNA鹏取4顿样品核酸，提取方法不限定，只要會^f呆ffi^取的DNAOI 26028o會鹏超iJl.6"2.0即可， 至Ul(M00ng/ml即可以。(2) 进俩介导^^增:鹏A_ ^W23MLLAMP鹏液的鹏管中力B入lpL待检样品赚DNA，和0.5nL的UNG瓶于 恒温95 。C體3—5 min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在ffi管中加入lnLBstDNA聚，；C. 于直温60—65。C體45 —90min;D. 将鹏调到80—95。C，鹏3—5min后中ibaM穀i」环介导^T增鹏的转基因;^卜麟 因(CP4EPSPS)双链目标靜U的扩增T^，取出待用。(3) J^^链目标序列鑭早附寻的单链目标序列与纳米CdS—^ft序滩斜己液中的feiBMt"序列微将J^X链目标序列在100 。C7K浴中煮沸10min，然Jg在冰浴中'K^4卩得到单链目标序列,取100 ML单链目标序列W^SM微孑版中，37T孵育过夜，再于60t千燥箱中0.5-1.5 h蒸干，用PBST清 鹏去其中未固定的单链目标序列；再取100nL ^fei鹏序列的纳米PbS—^m"序列fei己^S微 版中，并且在45"C7]Ci^^交2(M0min，得至lJ杂^t/双链DNA，取出该微孑画PBST、 PBS和7乂各冲 洗5次，每次一射中，以清洗除去除去未杂交的丰新己Mf序列，即得到固定了杂^^双链DNA时微 孑版。(4)电化翔啶将固定了杂^tl双链DNA时微孔板中残留的溶鹏出后取100 mL 1.0 mol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：环介导等温扩增反应扩增品系为ＧＴＳ４０－３－２的转基因大豆外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ，得到外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ的双链目标序列扩增产物，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化铅对来源于外源基因ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，且环介导等温扩增反应中的试剂包括： （１）环介导等温扩增反应液： 包括１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、３００－５００μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、２－４ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁、０．８－１．２μｍｏｌ上游内引物、０．８－１．２μｍｏｌ／Ｌ下游内引物、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ上游外引物、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ下游外引物和１－１．５ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱；１Ｕ／μＬ ＵＮＧ酶；其中１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；其中： 上游内引物：５－ＡＡＴＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣ－３、 下游内引物：５－ＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧ－３、 上游外引：５－ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴ－３、 下游外引物：５－ＡＴＣＧＧＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧ－３。 （２）Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶：８Ｕ／μＬ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟，高宏伟，焦奎，钟江华，覃鹏，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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