一种DNA探针池、包含其的淋巴瘤检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种DNA探针池、包含其的淋巴瘤检测试剂盒及其制备方法和应用。所述DNA探针池中的每个探针包括：5'末端生物素化标记和与淋巴瘤相关基因特异性结合的核苷酸序列。通过设计与目的片段互补的带有生物素标记的DNA探针，与靶向基因序列杂交，然后与抗生物素链酶亲和素抗体结合后用磁珠吸附，完成对多个与淋巴瘤相关的基因进行捕获。通过使用的二代测序方法一次便可通过检测多个与淋巴瘤相关的基因重排，成本更低，精度较高，为淋巴瘤的诊断和分型提供了基础。

A DNA probe pool, lymphoma detection kit containing it and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种DNA探针池、包含其的淋巴瘤检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种DNA探针池、包含其的淋巴瘤检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
恶性淋巴瘤(Malignantlymphoma，ML)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织，其主要临床表现是无痛性淋巴结肿大，全身各组织器官均可受累。淋巴瘤患者在发现淋巴结肿大前或同时可出现发热、盗汗、消瘦、皮肤瘙痒等全身症状。恶性淋巴瘤的诊断方法主要依靠病理学检查，结合临床表现及必要的相关实验检查，以明确病理类型及病变范围。根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病(Hodgkinsdisease，HD)及非何杰金恶性淋巴瘤(nonHodgkinsmalignantlymphoma，NHL)两大类，二者在发病率、临床经过、治疗及预后等方面存在明显差异。两大类淋巴瘤进而还可以细分为不同的组织学亚型，每一种病理类型有各自的形态学和免疫学表现、遗传学特征、特殊的临床特点和预后。因此，正确的病理分型是临床诊断、指定治疗方案和判断预后的重要前提。然而，淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难。淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因。一个T细胞、B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记。一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排。因此，对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断。荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，出现于20世纪70年代末的遗传学实验技术。它根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。FISH技术可在组织和细胞原位，对染色体整倍体及结构变异，以及靶基因的定位、扩增、缺失、断裂和融合进行检测。目前该技术已普遍应用于淋巴瘤的诊断与鉴别、预后诊断、用药指导等多个领域，然而该方法的成本较高，且准确度有待进一步提高。因此，开发一种用于检测精度较高、成本较低，同时能够实现淋巴瘤分型的检测试剂盒是本领域急需解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种DNA探针池、包含其的淋巴瘤检测试剂盒及其制备方法和应用，所述DNA探针池能够检测多种淋巴瘤产生的基因重排，为淋巴瘤的诊断和分型提供了基础。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种DNA探针池，所述DNA探针池中的每个探针包括：5'末端生物素化标记和与淋巴瘤相关基因特异性结合的核苷酸序列。本专利技术中，通过设计与目的片段互补的带有生物素标记的DNA探针，与靶向基因序列杂交，然后与抗生物素链酶亲和素抗体结合后用磁珠吸附，完成对多个与淋巴瘤相关的基因进行捕获。通过使用的二代测序方法一次便可通过检测多个与淋巴瘤相关的基因重排，较经典的FISH方法来说准确度更高，成本更低，同时相对于全外显子组测序来说，本专利技术只需对目标基因进行捕获，从而节约成本，也简化了后续数据分析。作为本专利技术优选的技术方案，所述淋巴瘤相关基因包括FCRL4、IGH、BCL6、CCND1、BIRC3、MALT1、BCL2、MYC、BCR或ABL1中的任意一种或两种以上的组合。优选地，所述淋巴瘤相关基因产生的基因重排包括FCRL4/IGH，IGH/BCL6，IGH/CCND1，BIRC3/MALT1，IGH/BCL2，IGH/MYC或BCR/ABL1中的任意一种或两种以上的组合本专利技术通过对美国国立综合癌症网络(NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN)发布的指南进行整理，从中选出最重要的FCRL4/IGH，IGH/BCL6，IGH/CCND1，BIRC3/MALT1，IGH/BCL2，IGH/MYC，BCR/ABL17种基因重排，涉及到的淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、非胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫大B淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、艾滋相关B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤等多种淋巴瘤。作为本专利技术优选的技术方案，所述DNA探针池中共有200～230条(例如可以是200条、205条、210条、215条、220条、225条或230条等)寡核苷酸探针。优选地，所述DNA探针池中每个所述寡核苷酸探针的浓度均为3～10pmole/μL，例如可以是3pmole/μL、4pmole/μL、5pmole/μL、6pmole/μL、7pmole/μL、8pmole/μL、9pmole/μL或10pmole/μL等。优选地，所述寡核苷酸探针的GC含量为30-70％，例如可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％等。优选地，所述寡核苷酸探针的序列长度为110～130bp，例如可以是110bp、112bp、115bp、120bp、125bp、128bp或130bp等。作为本专利技术优选的技术方案，所述DNA探针池包含216条寡核苷酸探针，所述216条寡核苷酸探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.216所示。DNA探针池共包括了淋巴瘤相关的10个基因全部外显子区域和UTR区域，共19.9KB。因此，本专利技术提供的探针池能全面覆盖淋巴瘤的疾病分型诊断、及预后指导。以SEQIDNO.1为例，其序列为：GTTCTGGAAGATCTTGAACCCTCTTCTGGAAAGGGGTACCTATTATTACTTTATGGGGCAGCAGCCTGGAAAAGTACTTGGGGACCAAAGAAGGCCAAGCTTGCCTGCCCTGCATTTTAT所述核苷酸序列委托IDT公司合成，返回所有寡核苷酸序列的混合液；在该混合液中，每条寡核苷酸序列的浓度均为3pmole。探针采用化学合成方式合成，每根探针浓度均一，准确度高，大大降低了探针池捕获的脱靶率。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的DNA探针池的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)选择淋巴瘤相关基因的外显子和UTR区域；(2)获取所述淋巴瘤相关基因的不同转录本，通过位置信息均映射到HG19人类标准参考基因组上，选取能够覆盖所有转录本的序列；(3)避开突变位点、SNP位点或插入缺失位点；(4)外显子部分向3'和5'端的内含子中各沿伸15-20bp得到所述寡核苷酸探针的核苷酸序列，合成得到所述探针池。本专利技术的探针设计原则具有一定的先进性，在设计时考虑了多种可能存在的脱靶情况，克服了检测精度问题，即使是低频的淋巴瘤变异也能够进行检测。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA探针池，其特征在于，所述DNA探针池中的每个探针包括：/n5'末端生物素化标记和与淋巴瘤相关基因特异性结合的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA探针池，其特征在于，所述DNA探针池中的每个探针包括：
5'末端生物素化标记和与淋巴瘤相关基因特异性结合的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的DNA探针池，其特征在于，所述淋巴瘤相关基因包括FCRL4、IGH、BCL6、CCND1、BIRC3、MALT1、BCL2、MYC、BCR或ABL1中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述淋巴瘤相关基因产生的基因重排包括FCRL4/IGH，IGH/BCL6，IGH/CCND1，BIRC3/MALT1，IGH/BCL2，IGH/MYC或BCR/ABL1中的任意一种或两种以上的组合。


3.根据权利要求1或2所述的DNA探针池，其特征在于，所述DNA探针池中共有200～230条寡核苷酸探针；
优选地，所述DNA探针池中每个所述寡核苷酸探针的浓度均为3-10pmole/μL；
优选地，所述寡核苷酸探针的GC含量为30-70％；
优选地，所述寡核苷酸探针的序列长度为110～130bp。


4.根据权利要求1-3任一项所述的DNA探针池，其特征在于，所述DNA探针池包含216条寡核苷酸探针，所述216条寡核苷酸探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.216所示。


5.一种如权利要求1-4任一项所述的DNA探针池的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏冬凯，顾凯丽，浦宇，吴洁，李芳，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32