小麦TaDA2基因Cas9载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了小麦TaDA2基因Cas9载体及其应用。本发明专利技术构建具有敲除DA2基因功能的小麦基因编辑载体，通过基因转化过程降低DA2基因的表达的水平，从而提高小麦千粒重。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平DA2基因的沉默，是利用基因工程技术改良小麦千粒重，提高小麦产量的有力工具。

Cas9 vector of wheat tada2 gene and its application

【技术实现步骤摘要】
小麦TaDA2基因Cas9载体及其应用
本专利技术涉及小麦TaDA2基因Cas9载体及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
小麦、水稻、玉米作为三大粮食作物，为人类提供一半以上的口粮。而小麦是世界上播种面积最大，产量最多和分布最广的粮食作物。随着世界人口的增加和可耕种土地面积的减少，提高作物的产量长期以来一直是很多作物育种改良的重要目标。目前，小麦的最高亩产纪录为烟农1212的828.5公斤。而在生产上，小麦的平均单产却为400公斤/亩左右。因此，从生产的角度，提高小麦单产的潜力很大。构成小麦产量的三要素是指单位面积的穗数、每穗粒数和千粒重。这三个因素也叫小麦的产量结构，三个因素的乘积就是小麦的单位面积产量。千粒重是以克表示的一千粒种子的重量，它是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的内容，也是田间预测产量时的重要依据。一般测定种子千粒重时是随机数出三个一千粒种子，分别称重，求其平均值。千粒重在不同品种之间有很大差异，有的大粒品种千粒重可达50～60克，一般中粒品种千粒重在40克左右，有些小粒品种在35克以下。因此，小麦千粒重的提高对小麦亩产量的提高具有重要意义。传统技术中通常是通过后期的种植管理技术提高小麦千粒重，比如选择适当时机浇注灌浆水、预防小麦倒伏等，或者通过改变小麦植株光合面积情况(如叶面积大小)而进行改变，这些方式通常只能是在一定范围内改变，作用效果有限。千粒重是一个数量性状，在作物中已经鉴定了几百个与籽粒性状包括粒长、粒宽和粒重等相关的QTL(QuantitativeTraitLoci)。这些QTL位点因能提高作物的产量，在驯化或育种过程中被正向选择而保留下来，这对作物的遗传改良具有重要意义。这些QTL位点基因的调控路径主要有三条(ZuoandLi,2014)：蛋白酶体降解途径、G蛋白信号途径和植物激素途径。其中，蛋白酶体降解途径主要是泛素(ubiquitinpathway)相关基因参与调节植物种子和器官大小(图1)。在这条路径中，E3泛素受连接酶活性蛋白DA2负相关于种子的大小，其突变体均表现出籽粒变大、粒重变重(Xiaetal.,2013)，可以利用这一相关特点通过基因编辑技术改善小麦的千粒重。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供小麦TaDA2基因Cas9载体及其应用。本专利技术构建具有敲除DA2基因功能的小麦基因编辑载体，通过基因转化过程降低DA2基因的表达的水平，从而提高小麦千粒重。小麦TaDA2基因Cas9载体，包括小麦TaU3启动子A调控sgRNA表达的表达框U3-sgRNA和启动子B调控Cas9表达的表达框；所述表达框U3-sgRNA具体自上游至下游依次包括如下元件：来自小麦的TaU3启动子A，TaDA2基因的sgRNA、终止子A；所述启动子B调控的Cas9表达的表达框具体自上游至下游依次包括如下元件：启动子B、玉米Cas9编码序列、终止子B。进一步的，所述TaDA2基因的sgRNA的DNA序列如序列SEQ10所示；所述玉米Cas9编码序列如SEQ13所示；所述TaU3启动子A的序列如SEQ3所示；所述启动子B序列如SEQ4所示；所述终止子A序列如SEQ5所示；所述终止子B序列如SEQ6所示。进一步的，所述表达框U3-sgRNA序列具体如SEQ7所示；所述启动子B调控的Cas9表达的表达框序列具体如SEQ8所示；所述表达框U3-sgRNA位于所述启动子B调控的Cas9表达的表达框的上游，表达框U3-sgRNA和启动子B调控的Cas9表达的表达框相互串联。进一步的，所述小麦TaDA2基因Cas9载体还含有抗性标记基因，如bar基因；所述小麦TaDA2基因Cas9载体的核苷酸序列如SEQ9所示。进一步的，上述小麦TaDA2基因Cas9载体的构建方法包括如下步骤：S11设计靶向TaDA2基因的sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的引物是如SEQ1所示的DA2-gR1-TaU3-F和如SEQ2所示的DA2-gR1-TaU3-R；S12将合成的sgRNA的2条oligo进行磷酸化和退火形成双链；S13利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；S14将回收的pBUE411载体片段和带有粘性末端的双链sgRNA进行通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的载体。含有所述小麦TaDA2基因Cas9载体的转化体也属于本专利技术保护范围。所述小麦TaDA2基因Cas9载体可应用于降低小麦DA2基因表达水平。所述小麦TaDA2基因Cas9载体在小麦千粒重改良中的应用。所述小麦TaDA2基因Cas9载体在培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦的千粒重增加。本专利技术还保护如下一段DNA片段Ⅰ，所述DNA片段Ⅰ由DA2基因的引导sgRNA组成，其序列具体可如序列SEQ10所示。有益效果：本专利技术通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现DA2基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦DA2基因。DA2基因在小麦中位于第四号染色体的4A，4B和4D上，分别命名为TaDA2-4A、TaDA2-4B和TaDA2-4D。其基因组序列在4A、4B和4D上的全长分别为3078、2644和3086个碱基，TaDA2-4A和TaDA2-4D部分同源基因均由12个外显子和11个内含子组成，TaDA2-4B由10个外显子和9个内含子组成。TaDA2-4A、TaDA2-4B和TaDA2-4D分别含1512、1512和1509个碱基的开放阅读框，分别编码一段含504、504和503个氨基酸残基的多肽链。根据这些基因信息，我们利用同源克隆的方法，在济麦22中克隆到TaDA1-2A基因，并提交到NCBI中，GenBank号为KU216228。这三个部分同源基因之间，除了第一个外显子外，其他的外显子相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaDA2基因提供了理论依据。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平DA2基因的沉默，是利用基因工程技术改良小麦千粒重，提高小麦产量的有力工具。附图说明图1DA2基因的编码区。图2pBUE411载体BsaI酶切电泳图；1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000Marker；3为1kbMarker。图3靶向DA2基因CRISPR/Cas9重组载体pBUE411-DA2测序结果。图4Bar试纸条检测转基因小麦植株。图5野生型小麦DA2基因的推导氨基酸序列。图6突变型小麦DA2基因的推导氨基酸序列。图7野生型和突变型的DA2基因核苷酸序列比对图。图8野生型和突变型的DA2基因的推导氨基酸序列比对图。图9TaDA2基因编辑植株籽粒表型。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小麦TaDA2基因Cas9载体，其特征在于，包括小麦TaU3启动子A调控sgRNA表达的表达框U3-sgRNA和启动子B调控Cas9表达的表达框；/n所述表达框U3-sgRNA具体自上游至下游依次包括如下元件：来自小麦的TaU3启动子A，TaDA2基因的sgRNA、终止子A；/n所述启动子B调控的Cas9表达的表达框具体自上游至下游依次包括如下元件：启动子B、玉米Cas9编码序列、终止子B。/n

【技术特征摘要】
20190417 CN 20191030648791.小麦TaDA2基因Cas9载体，其特征在于，包括小麦TaU3启动子A调控sgRNA表达的表达框U3-sgRNA和启动子B调控Cas9表达的表达框；
所述表达框U3-sgRNA具体自上游至下游依次包括如下元件：来自小麦的TaU3启动子A，TaDA2基因的sgRNA、终止子A；
所述启动子B调控的Cas9表达的表达框具体自上游至下游依次包括如下元件：启动子B、玉米Cas9编码序列、终止子B。


2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述TaDA2基因的sgRNA序列如序列SEQ10所示；
所述玉米Cas9编码序列如SEQ13所示；
所述TaU3启动子A的序列如SEQ3所示；
所述启动子B序列如SEQ4所示；
所述终止子A序列如SEQ5所示；
所述终止子B序列如SEQ6所示。


3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述表达框U3-sgRNA序列具体如SEQ7所示；
所述启动子B调控的Cas9表达的表达框序列具体如SEQ8所示；
所述表达框U3-sgRNA位于所述启动子B调控的Cas9表达的表达框的上游，表达框U3-sgRNA和启动子B调控的Cas9表达的表达框相互串联。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣志，李根英，李玉莲，张淑娟，宋国琦，李玮，高洁，李吉虎，陈明丽，刘敏，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37