一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法技术

本发明专利技术公开了一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，包括如下步骤：(1)构建载体：正对照载体采用p1300LV载体，同时构建相应的负对照载体；(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的片段，再与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；(3)制备水稻原生质体；(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在PEG介导下共培养，进行转化；(5)显微镜观察荧光信号。本发明专利技术方法首次提出了通过水稻瞬时转化验证增强子活性的方法，高效，快捷。

An efficient protoplast verification method for the identification of rice enhancers

【技术实现步骤摘要】
一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法
本专利技术涉及增强子鉴定方法，特别涉及一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法。
技术介绍
增强子是一种重要的顺式作用元件，它在基因组的分布具有不确定性，所调控的靶基因距离也不确定，可位于靶基因启动子上游、基因下游、基因内或基因间区。增强子序列不保守，没有明显序列特征，给鉴定工作带来了困难。增强子与反式作用因子结合发挥作用，它通过招募不同反式作用因子来重塑染色质，改变染色质构象，进而增强子激活靶基因的转录，参与基因表达调控。在植物中通过建立增强子捕获株系突变体库筛选到有功能的增强子。但该方法需要筛选大量的转基因材料，因此研究周期长，结果随机性强和可靠性差。近年来，随着ChIP-seq、DNase-seq等技术的发展，借助生物信息学的方法越来越多的增强子被预测出来。但现有验证技术不够高效、快捷。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术目的是提供一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法。本专利技术构建验证增强子活性的表达载体，结合水稻原生质体瞬时转化方法，转化后在共聚焦显微镜下观察转化子中是否有荧光，从而明确增强子活性强弱，同时缩短实验周期。技术方案：本专利技术提供一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，包括如下步骤：(1)构建载体：正对照载体采用p1300LV载体，同时构建相应的负对照载体；(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的片段，再与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；(3)制备水稻原生质体；(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在PEG介导下共培养，进行转化；(5)显微镜观察荧光信号。进一步地，所述步骤(1)中负对照载体构建是将p1300LV载体线性化后，PCR扩增启动子序列，得到序列SEQIDNO1，将2个片段连接，筛选阳性转化子，测序验证。所述步骤(1)中使用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切p1300LV载体，去掉CaMV35S启动子，得到线性化载体。所述步骤(1)中采用大肠杆菌DH5α筛选阳性转化子。所述水稻品种为日本晴。所述步骤(2)中BsaI酶切位点位于启动子下游，距离启动子约4.5kb。上述技术方案中：在正对照载体p1300LV中CaMV35S启动子能够启动报告基因GFP表达，在瞬时转化后观察到绿色荧光。负对照载体使用启动子活性较弱的启动子则不能启动报告基因GFP的表达，即在在原生质体转化后检测不到荧光。根据增强子可远距离调控表达的特征，在启动子下游(约4.5kb)插入增强子序列，转化后观察转化子是否有荧光，如果有荧光，则说明增强子有活性。构建选取部分增强子，详细信息见表1。将增强子连接在启动子的下游，如图1所示。原生质体转化后使用共聚焦显微镜进行观察，对增强子的活性进行快速鉴定。有益效果：本专利技术首次提出了通过水稻瞬时转化验证增强子活性的方法，该方法操作简单，耗时短，能够对生物信息学预测出的增强子进行快速验证，对进一步研究增强子功能提供了重要依据。附图说明图1是增强子验证载体的结构示意图，正对照为CaMV35S启动GFP表达；负对照为启动子活性较弱的启动子驱动GFP表达；将负对照载体作为骨架载体，通过远端的BsaI酶切将候选的增强子整合进来，构建增强子表达载体；图2为是水稻原生质体中增强子的活性检测，其中CK(+)、CK(-)，结构如图1所示，OsENH1-4为实施例的候选增强子。具体实施方式本实施例的方法如下：1.构建载体正对照载体为p1300LV载体，该载体为CaMV35S启动子驱动报告基因GFP表达。负对照载体构建方法为：在p1300LV载体中用限制性内切酶NcoI和BamHI将酶切掉CaMV35S启动子，使载体线性化；PCR扩增启动子序列，得SEQIDNO1，使用连接试剂盒将2个片段快速连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，测序验证。载体示意图如图1所示。2.增强子的分离克隆及表达载体构建生物信息学分析方法选取4个增强子序列，命名为OsENH1-4。表1为候选增强子及其在染色体上的具体位置。其中OsENH1序列参见：Wu,Changyin&Li,Xiangjun&Yuan,Wenya&Chen,Guoxing&Kilian,Andrzej&Li,Juan&Xu,Caiguo&Li,Xianghua&Zhou,D.-X&Wang,Shiping&Zhang,Qifa.(2003).Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.ThePlantjournal35(3):418-27.10.1046/j.1365-313X.2003.01808.x.OsENH2-4增强子序列获得方法：通过DNase-seq研究方法获得水稻基因组开放染色质作图，高通量预测并鉴定了开放染色质区域，结合表观遗传学标记，预测基因组中增强子位点。以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用特异引物PCR扩增得到目的片段(引物序列见表2)。BsaI酶切位点位于启动子下游，距离启动子约4.5kb，将每一个增强子序列与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到各自的增强子表达载体。表1本实验的候选增强子编号染色体上位置OsENH1Chr10:3542500-3543500OsENH2Chr7:20735655-20735737OsENH3Chr2:3344121-3344503OsENH4Chr5:24061158-24061582表2本实验所使用的引物序列引物名称引物序列(5’to3’)OsENH1FaaggtcgaaaaggtctctcggcggaggcgatgcacgcOsENH1RatgtacgtgctatccacaccacaaataacccaatctgOsENH2FaaggtcgaaaaggtctctgtacttacgcacacactttgOsENH2RatgtacgtgctatccacagcttgaattcagatattgctOsENH3FaaggtcgaaaaggtctctgaaaacagctgcagaaatgcOsENH3RatgtacgtgctatccacatgatcttatccaatctgttcOsENH4Faaggtcgaaaaggtctctgaagagc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)构建载体：正对照载体采用p1300LV载体，同时构建相应的负对照载体；/n(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的片段，再与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；/n(3)制备水稻原生质体；/n(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在PEG介导下共培养，进行转化；/n(5)显微镜观察荧光信号。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建载体：正对照载体采用p1300LV载体，同时构建相应的负对照载体；
(2)增强子的分离克隆及表达载体构建：选取增强子序列，以水稻基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的片段，再与BsaI酶线性化的负对照载体连接，得到增强子表达载体；
(3)制备水稻原生质体；
(4)水稻原生质体的转化：将增强子表达载体与水稻原生质体在PEG介导下共培养，进行转化；
(5)显微镜观察荧光信号。


2.根据权利要求1所述的高效鉴定水稻增强子的原生质体验证方法，其特征在于：所述步骤(1)中负对照载体构建是将p1300LV载体线性化后，PCR扩增启动子序列，得到序列S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张韬，李鑫琪，刘鹏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32