一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法技术

本发明专利技术公开了一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，包括如下步骤：利用乙醇和次氯酸钠消毒花烟草种子，转接到MS固体培养基中，待60d后发育成无菌苗。制作发根农杆菌A4的侵染液，切下花烟草幼嫩子叶浸入该侵染液中，7‑15d后长出毛状根，利用抗生素进行抑菌、除菌后扩繁。本发明专利技术方法适用于多种花烟草的毛状根诱导，具有取材方便、诱导率高、遗传稳定等优点。

A transformation method of hairy roots of Nicotiana tabacum mediated by Agrobacterium rhizogenes

【技术实现步骤摘要】
一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法
本专利技术涉及农业生物技术研究领域，特别是涉及一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法。
技术介绍
花烟草（NicotianaalataLinketOtto）隶属茄科（Solanaceae），烟草属（NicotianaL）多年生草本植物，常作为盆栽养殖，具有很高的观赏价值。在我国哈尔滨、北京、南京等市有引种栽培。是研究基于S-核酸酶自交不亲和反应的重要材料。花烟草其染色体（2n=18）与普通烟草(2n=48)具有很明显的细胞学特征，可作为组织培养及细胞杂交的实验对象（李向辉等，花烟草原生质体的再生植株，遗传，1982）。发根农杆菌(Agrobaeteriumrhizogenes)A4，是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)农杆菌(Agrobactefium)一类G-土壤杆菌，天然农杆碱型。可以侵染多数双子叶植物和少数单子叶植物。发根农杆菌的Ri质粒通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。而植物在受到伤害后体内会分泌出一种酚类物质，能激活vir基因，促使Ri质粒转入到植物细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，其特征在于包括以下步骤：/n步骤一、花烟草无菌苗的获得/n将花烟草种子用洗洁精侵泡、再流水冲洗，于超净工作台用75％乙醇处理45-60s，无菌水冲洗2次，10％NaClO消毒8-13min，再用无菌水冲洗2次，置于MS培养基上培养；/n步骤二、侵染液的制备/n在含有100mg/L Kan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天，挑单菌落入100mg/L Kan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化，当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rol B基因；若菌液中存在rolB基因，则离心去...

【技术特征摘要】
1.一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、花烟草无菌苗的获得
将花烟草种子用洗洁精侵泡、再流水冲洗，于超净工作台用75％乙醇处理45-60s，无菌水冲洗2次，10％NaClO消毒8-13min，再用无菌水冲洗2次，置于MS培养基上培养；
步骤二、侵染液的制备
在含有100mg/LKan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天，挑单菌落入100mg/LKan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化，当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rolB基因；若菌液中存在rolB基因，则离心去上清液，转入到MS液体培养基中，加入100μmol/L乙酰丁香酮混匀后获得侵染液；
步骤三、毛状根的获得
(1)花烟草叶片预培养
当花烟草生长2-3月时，选择长势较好的花烟草植株，切取其叶片，切掉叶尖、叶基、叶缘，留取1.5cm*1.5cm的叶片，放入MS固体培养基中预培养2d；

【专利技术属性】
技术研发人员：江龙，卢锡锋，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52