一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法技术

本发明专利技术公开了一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，包括如下步骤：利用乙醇和次氯酸钠消毒花烟草种子，转接到MS固体培养基中，待60d后发育成无菌苗。制作发根农杆菌A4的侵染液，切下花烟草幼嫩子叶浸入该侵染液中，7‑15d后长出毛状根，利用抗生素进行抑菌、除菌后扩繁。本发明专利技术方法适用于多种花烟草的毛状根诱导，具有取材方便、诱导率高、遗传稳定等优点。

A transformation method of hairy roots of Nicotiana tabacum mediated by Agrobacterium rhizogenes

【技术实现步骤摘要】
一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法
本专利技术涉及农业生物技术研究领域，特别是涉及一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法。
技术介绍
花烟草（NicotianaalataLinketOtto）隶属茄科（Solanaceae），烟草属（NicotianaL）多年生草本植物，常作为盆栽养殖，具有很高的观赏价值。在我国哈尔滨、北京、南京等市有引种栽培。是研究基于S-核酸酶自交不亲和反应的重要材料。花烟草其染色体（2n=18）与普通烟草(2n=48)具有很明显的细胞学特征，可作为组织培养及细胞杂交的实验对象（李向辉等，花烟草原生质体的再生植株，遗传，1982）。发根农杆菌(Agrobaeteriumrhizogenes)A4，是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)农杆菌(Agrobactefium)一类G-土壤杆菌，天然农杆碱型。可以侵染多数双子叶植物和少数单子叶植物。发根农杆菌的Ri质粒通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。而植物在受到伤害后体内会分泌出一种酚类物质，能激活vir基因，促使Ri质粒转入到植物细胞中，因此在侵染液中加入乙酰丁香酮（As）可增强转化率。花烟草具有很高的观赏价值，同时具有很明显的细胞生物学特征，作为细胞杂交的重要实验研究材料，目前国内尚未有利用发根农杆菌诱导花烟草产生毛状根的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供本专利技术提供一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，包括以下步骤：步骤一、花烟草无菌苗的获得将花烟草种子用洗洁精侵泡、再流水冲洗，于超净工作台用75%乙醇处理45-60s，无菌水冲洗2次，10%NaClO消毒8-13min，再用无菌水冲洗2次，置于MS培养基上培养；步骤二、侵染液的制备在含有100mg/LKan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天，挑单菌落入100mg/LKan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化，当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rolB基因；若菌液中存在rolB基因，则离心去上清液，转入到MS液体培养基中，加入100μmol/L乙酰丁香酮混匀后获得侵染液；步骤三、毛状根的获得（1）花烟草叶片预培养当花烟草生长2-3月时，选择长势较好的花烟草植株，切取其叶片，切掉叶尖、叶基、叶缘，留取1.5cm*1.5cm的叶片，放入MS固体培养基中预培养2d；（2）花烟草叶片的侵染及共培养预培养后的花烟草叶片侵入制备好的侵染液中，侵泡8-10min后用无菌滤纸吸取多余菌液，置于MS固体培养基中25℃暗培养2d；（3）花烟草叶片抑菌培养2-3d后转到含500mg/L头孢霉素固体培养基中抑菌培养，5-7d转接一次，15-20d左右在叶片边缘将长出毛状根。（4）花烟草毛状根的除菌培养及扩繁待毛状根长到3~5cm时，将毛状根从距离叶基部2~3cm处剪下，置于含500mg/LCef的MS固体培养基中培养，逐级降低Cef浓度直到无菌。再置于1/2MS培养基上扩增培养；优选的，步骤一中，花烟草种子的消毒时间为75%乙醇处理60s，10%NaClO消毒13min。优选的，步骤三（1）中，叶片预培养切掉叶尖、叶基、叶缘，留取叶片中间部分。与现有技术相比，经由上述技术方案，本专利技术采用侵染菌液OD600值为0.6，侵染时间为8min，共培养时间为2d，毛状根发生率高，能快速、高效的诱导出花烟草毛状根。通过本专利技术获得的花烟草毛状根遗传稳定、繁殖快速、过程简单等优点。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。花烟草作为一种重要的细胞杂交的实验材料，同时也可作为观赏性植物，具有很高的研究价值。本专利技术公开了一种花烟草毛状根的获得方法，具有直观、快速获得花烟草-毛状根遗传转化体系的特点。实施例1花烟草无菌苗的获得，包括步骤：（1）将花烟草种子用洗洁精侵泡5分钟，再流水冲洗30分钟。（2）于超净工作台用75%乙醇处理45s，无菌水冲洗2次（3）10%NaClO消毒8min，再用无菌水冲洗2次（4）置于MS培养基上培养，25℃、光强2000lx培养。在含有100mg/LKan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天。挑单菌落入100mg/LKan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化。当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rolB基因。若菌液中存在rolB基因，则3000rpm离心10分钟去上清液，转入到50mLMS液体培养基中。加入100μmol/LAs混匀后获得侵染液。在活化发根农杆菌的同时，选择长势较好的花烟草植株，在超净工作台上，切取其叶片，切掉叶尖、叶基、叶缘，留取1.5cm*1.5cm的叶片,放于MS固体培养基中预培养2d。将预培养后的花烟草叶片侵入制备好的侵染液中，侵泡8-10min后用无菌滤纸吸取多余菌液，置于MS固体培养基中25℃暗培养2d。2-3d后转到含500mg/LCef（头孢霉素）固体培养基中抑菌培养，5-7d转接一次，15-20d左右在叶片边缘将长出毛状根。待毛状根长到3~5cm时，将毛状根从距离叶基部2~3cm处剪下，置于含500mg/LCef的MS固体培养基中培养，逐级降低Cef浓度直到无菌。再置于1/2MS培养基上扩增培养。尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，其特征在于包括以下步骤：/n步骤一、花烟草无菌苗的获得/n将花烟草种子用洗洁精侵泡、再流水冲洗，于超净工作台用75％乙醇处理45-60s，无菌水冲洗2次，10％NaClO消毒8-13min，再用无菌水冲洗2次，置于MS培养基上培养；/n步骤二、侵染液的制备/n在含有100mg/L Kan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天，挑单菌落入100mg/L Kan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化，当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rol B基因；若菌液中存在rolB基因，则离心去上清液，转入到MS液体培养基中，加入100μmol/L乙酰丁香酮混匀后获得侵染液；/n步骤三、毛状根的获得/n(1)花烟草叶片预培养/n当花烟草生长2-3月时，选择长势较好的花烟草植株，切取其叶片，切掉叶尖、叶基、叶缘，留取1.5cm*1.5cm的叶片，放入MS固体培养基中预培养2d；/n(2)花烟草叶片的侵染及共培养/n预培养后的花烟草叶片侵入制备好的侵染液中，侵泡8-10min后用无菌滤纸吸取多余菌液，置于MS固体培养基中25℃暗培养2d；/n(3)花烟草叶片抑菌培养/n2-3d后转到含500mg/L头孢霉素固体培养基中抑菌培养，5-7d转接一次，15-20d左右在叶片边缘将长出毛状根。/n(4)花烟草毛状根的除菌培养及扩繁/n待毛状根长到3～5cm时，将毛状根从距离叶基部2～3cm处剪下，置于含500mg/L Cef的MS固体培养基中培养，逐级降低Cef浓度直到无菌。再置于1/2MS培养基上扩增培养。/n...

【技术特征摘要】
1.一种以发根农杆菌介导的花烟草毛状根诱导转化方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、花烟草无菌苗的获得
将花烟草种子用洗洁精侵泡、再流水冲洗，于超净工作台用75％乙醇处理45-60s，无菌水冲洗2次，10％NaClO消毒8-13min，再用无菌水冲洗2次，置于MS培养基上培养；
步骤二、侵染液的制备
在含有100mg/LKan的YEP固体培养基上划线分离发根农杆菌A4，28℃暗培养2-3天，挑单菌落入100mg/LKan的YEP液体培养基中28℃、180rpm二次活化，当菌液OD600值达到0.6-0.8时，凝胶电泳进行PCR检测rolB基因；若菌液中存在rolB基因，则离心去上清液，转入到MS液体培养基中，加入100μmol/L乙酰丁香酮混匀后获得侵染液；
步骤三、毛状根的获得
(1)花烟草叶片预培养
当花烟草生长2-3月时，选择长势较好的花烟草植株，切取其叶片，切掉叶尖、叶基、叶缘，留取1.5cm*1.5cm的叶片，放入MS固体培养基中预培养2d；

【专利技术属性】
技术研发人员：江龙，卢锡锋，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52