通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用，属于发酵技术领域，本发明专利技术利用基因重组技术，首先将核糖开关ydaO模块、ppk基因、gshf基因片段和质粒载体重组构建重组质粒，然后将重组质粒转入到大肠杆菌感受态中，在大肠杆菌中构建基于核糖开关ydaO模块和聚磷酸激酶（ppk）的ATP调控方法，可实现控制ATP浓度在一定水平，从而利于胞内ATP依赖性产物的合成。

Recombinant plasmids, engineering bacteria and their applications for glutathione synthesis by dynamic regulation of ATP

【技术实现步骤摘要】
通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
本专利技术属于发酵
，具体地，涉及通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用。
技术介绍
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是细胞内广泛存在的生物活性小分子物质，在生物体内发挥着重要的生理功能。GSH对于维持体内适宜的氧化还原环境起着重要作用，同时谷胱甘肽具有提高机体免疫力和抗氧化等功能，在临床医药和食品加工领域都有着广泛的用途。谷胱甘肽在细胞内以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸谷为底物，通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS,EC6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(GS,EC6.3.2.3)在ATP存在下催化这三种底物氨基酸合成。无论是通过哪种微生物发酵生产谷胱甘肽，ATP的供应都是至关重要的。目前关于提高ATP水平来促进产物合成的研究多集中在发酵过程的控制优化方面。例如，添加柠檬酸等能量底物来提高胞内ATP水平或者加入正己烷、正庚烷一类的携氧载体来促进胞内ATP的合成。也有直接添加ATP的方式解决底物ATP的供给问题。然而ATP价格昂贵，且难以通过细胞膜，因此无法通过直接添加的方式解决ATP的供给问题。也有学者通过基因工程手段构建ATP再生系统来提高ATP的供应，如引入磷酸烯醇丙酮酸与丙酮酸激酶，磷酸肌酸与肌酸激酶，乙酰磷酸与乙酸激酶，聚磷酸(polyP)与聚磷酸激酶（PPK）。但是这些方法的调控范围有限，只能单一实现胞内ATP水平的上调或者下调。在枯草芽孢杆菌中发现的天然RNA模块ydaO作为核糖开关，可以通过响应胞内ATP水平而调控基因的表达。当胞内ATP浓度高于一定水平，ydaO模块和ATP分子作用形成茎环结构的RNA，阻碍ydaO下游基因的转录；反之，当胞内ATP浓度低于一定水平，ydaO模块本身可作为启动子元件开启下游基因的转录。提高胞内ATP水平有利于ATP依赖型产物的合成，但是ATP水平过高可能会对细胞造成不良的影响，例如会阻碍细胞的生长。大多数聚磷酸激酶只有在具有10多个磷酸盐残基的聚磷酸盐存在下才具有活性。最近从谷氨酸棒状杆菌中发现的ppk编码的聚磷酸激酶可以利用廉价的poly(3)或poly(4)作为磷酸盐供体，从ADP再生ATP，具有更大的工业潜力。
技术实现思路
为了解决现有技术中单一调控胞内ATP水平的问题，本专利技术的目的一在于提供一种通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒，目的二在于提供一种工程菌，目的三在于提供利用所述工程菌促进谷胱甘肽合成方面的应用。通过基因重组技术，在大肠杆菌中构建基于核糖开关ydaO模块和聚磷酸激酶（ppk）的ATP调控方法，可实现控制ATP浓度在一定水平，从而利于胞内ATP依赖性产物的合成。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种重组质粒，由核糖开关ydaO模块、提高胞内ATP水平的基因、gshf基因片段和质粒载体重组构建而成；所述提高胞内ATP水平的基因连接在核糖开关ydaO模块的下游。作为对上述方案的进一步优化，所述核糖开关ydaO模块来源于枯草芽孢杆菌。作为对上述方案的进一步优化，所述提高胞内ATP水平的基因为来源于谷氨酸棒状杆菌的ppk基因。作为对上述方案的进一步优化，所述质粒载体为pRSFDuet-1质粒。本方面还提供一种工程菌，是将上述的重组质粒转入谷胱甘肽产生菌中而得到的。进一步地，所述谷胱甘肽产生菌为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术还进一步提供利用所述的工程菌发酵生产谷胱甘肽的方法，将所述工程菌在LB培养基中过夜培养，然后接种到发酵培养基中发酵；当菌体生物量至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，并加入终浓度为15-50mmol/L的三聚磷酸钠，继续培养至发酵结束。所述发酵培养基为M9培养基；所述M9培养基的配方为：每1L体积中含有葡萄糖20g、Na2HPO4·2H2O7.52g、KH2PO43g、NaCl0.5g、NH4Cl0.5g、MgSO4·2H2O0.25g、CaCl2·2H2O0.15g、生物素1g、硫胺素1g和100×微量元素溶液10ml；所述100×微量元素溶液的配方为：每1L体积中含有EDTA5g、FeCl3·6H2O0.83g、ZnCl284mg、CuCl2·2H2O13mg、CoCl2·2H2O10mg、H3BO310mg和MnCl2·4H2O1.6mg。本专利技术另外提供所述的工程菌在通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成方面的应用。有益效果：1、本专利技术利用枯草芽孢杆菌中发现的ATP核糖开关ydaO模块动态调控胞内ATP水平，并通过表达双功能谷胱甘肽合成酶GshF，促进谷胱甘肽生物合成。2、本专利技术提出了一种基于ATP核糖开关ydaO模块和谷氨酸棒状杆菌来源的聚磷酸激酶的ATP调控策略，以提高大肠杆菌胞内谷胱甘肽的合成。本专利技术设计将能提高胞内ATP水平的基因(ppk)连接在核糖开关ydaO模块的下游，构建基于核糖开关ydaO模块和聚磷酸激酶（ppk）的ATP调控方法，该方法可以响应大肠杆菌胞内ATP浓度。当胞内ATP水平高时，ydaO下游的基因不表达或者表达较少。当胞内的ATP水平降低时，ydaO开启转录，胞内ATP水平提高，谷胱甘肽产物合成能力提高。开发的ATP调控系统可以实现一定水平下ATP浓度的动态控制，在不影响生物量的前提下促进细胞内谷胱甘肽合成。此外该方法对于其他ATP依赖性产物的合成也有一定的应用价值。附图说明图1是ATP动态调控谷胱甘肽合成的原理示意图；图2是pRSFDuet-ydaO质粒图谱的质粒构建图谱；图3是pRSFDuet-ppk质粒构建图谱；图4是pRSFDuet-ydaO-ppk质粒构建图谱；图5是pRSFDuet-ydaO-ppk-gshf质粒构建图谱；图6是pRSFDuet-ydaO-gfp质粒构建图谱；图7是不同磷酸盐浓度对于菌株AYG胞内ATP和荧光强度的影响图；图8是不同磷酸盐浓度对于菌株ControlY胞内ATP和荧光强度的影响图；图9是ATP调控系统对于工程菌和对照菌的生物量影响图；图10是ATP调控系统对于工程菌和对照菌的谷胱甘肽合成浓度影响图；图11是ATP调控系统对于工程菌和对照菌的ATP浓度、ATP/ADP比率的影响图；图12是ATP调控系统和双功能谷胱甘肽合成酶对于工程菌和对照菌的谷胱甘肽浓度影响图。具体实施方式一种动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的工程菌，其构建方法按照以下的步骤进行：(1)纯化扩增出枯草芽孢杆菌中的ydaO基因片段，构建得到重组质粒pRSFDuet-ydaO；(2)纯化扩增出谷氨酸棒状杆菌的ppk基因，构建得到重组质粒pRSFDuet-ppk和pRSFDuet-ydaO-ppk，用于胞内ATP水平的动态调控；(3)纯化扩增出嗜热链球菌中的gshf基因片段，构建得到重组质粒pRSFDue本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于：由核糖开关ydaO模块、提高胞内ATP水平的基因、gshf基因片段和质粒载体重组构建而成；所述提高胞内ATP水平的基因连接在核糖开关ydaO模块的下游。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于：由核糖开关ydaO模块、提高胞内ATP水平的基因、gshf基因片段和质粒载体重组构建而成；所述提高胞内ATP水平的基因连接在核糖开关ydaO模块的下游。


2.根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于：所述核糖开关ydaO模块来源于枯草芽孢杆菌。


3.根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于：所述提高胞内ATP水平的基因为来源于谷氨酸棒状杆菌的ppk基因。


4.根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于：所述质粒载体为pRSFDuet-1质粒。


5.一种工程菌，是将权利要求1-4任意一种所述的重组质粒转入谷胱甘肽产生菌中而得到的。


6.根据权利要求5所述的一种工程菌，所述谷胱甘肽产生菌为大肠杆菌BL21(DE3)。


7.利用权利要求6所述的工程菌发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于：将所述工程菌在L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雅维，柴骏，廖源，孔维臻，王书涵，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41