一种原核表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种原核表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种原核表达载体，以pET‑32a为原始载体，在其基础上进行改造；双酶切pET‑32a原核表达载体，并合成两条含rbs序列及分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位点的单链，退火形成带缺口的双链，进而连入双酶切的pET‑32a原核表达载体，形成仅含单一his标签的原核表达载体pET‑32a‑gai。PCR扩增C蛋白的基因序列，将其连入pET‑32a‑gai原核表达载体形成pET‑32a‑gai‑C原核表达载体。本发明专利技术的原核表达载体将在外源小分子蛋白(特别是猪瘟病毒石门株衣壳蛋白C)表达的生产中发挥重要作用。

A prokaryotic expression vector and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种原核表达载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种原核表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，除北美洲和大洋洲外几乎遍及全世界，是危害养猪业安全的重要疫病之一。C蛋白是CSFV编码的第一个结构蛋白，构成病毒的核衣壳，在病毒的增殖过程中发挥重要作用。研究发现，C蛋白上存在的抗原表位对T、B淋巴细胞介导的免疫反应有重要作用，但不能诱导机体产生中和性抗体。己经证实与CSFV同科的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的C蛋白具有免疫原性，丙型肝炎病毒的C蛋白已经被用于临床感染治疗和疫苗研发。由此推测CSFV的C蛋白可能具有与之相似的免疫学特性和功能。因此，C蛋白在基础研究与临床应用上具有重要价值。猪瘟病毒C蛋白抗体是进行CSFV研究的重要材料，且市场上很难买到好用的C蛋白抗体，所以自制C蛋白抗体非常必要，而C蛋白的原核表达为C蛋白抗体的制备奠定了重要的材料基础。因此，提供一种原核表达载体及其构建方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原核表达载体，其特征在于，是由pET-32a改造获得的仅含单一his标签的原核表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种原核表达载体，其特征在于，是由pET-32a改造获得的仅含单一his标签的原核表达载体。


2.根据权利要求1所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以pET-32a为原始载体，利用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切pET-32a原核表达载体；
(2)合成两条含rbs序列及分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位点的单链，退火形成带缺口的双链；
所述两条单链序列分别为：
a：5’-CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGATCCGCGGAATTCC-3’；SEQIDNO.1；
b：5’-TCGAGGAATTCCGCGGATCCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTT-3’；SEQIDNO.2；
(3)将步骤(2)合成的双链与步骤(1)双酶切的pET-32a原核表达载体连接，经转化、培养、测序，获得仅含单一his标签的原核表达载体pET-32a-gai。


3.根据权利要求2所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)将两条单链序列95℃-60℃依次梯度退火，每个梯度5℃，每个梯度退火5min，形成一条有缺口的双链。

【专利技术属性】
技术研发人员：郭抗抗，赵娣，张亮，张彦明，刘勇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61