一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法技术

本发明专利技术公开了一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，包括以下步骤：耐药基因信息挖掘：通过NCBI检索并下载genbank中的所有blaKPC和blaNDM基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临PAM基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点。本发明专利技术所述的一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，公开了耐药质粒的靶向序列，该序列能够引导Cas9酶切蛋白，对含有互补序列的耐药基因进行酶切，其次能够定向且高效的清除对碳青酶烯类抗生素耐药的肠杆菌细菌(CRE)所携带的kpC基因、NDM基因和携带质粒，为耐药质粒功能研究提供模式菌株，并为CRE的防治提供新的思路，带来更好的使用前景。

A method of removing resistant plasmids from Enterobacteriaceae

【技术实现步骤摘要】
一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法
本专利技术涉及基因编辑
，特别涉及一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法。
技术介绍
肠杆菌科是一大类不同类型的细菌，通常在医疗机构中引起感染。其中最为多见的是大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌。当肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的抗生素产生抗药性时，细菌被称为对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科(CarbapenemResistantEnterobacteriaceae，CRE)。目前，CRE对临床上使用的绝大多数抗生素均耐受，对公共卫生构成巨大威胁。肠杆菌科中对碳青霉烯类的抗药性通常是细菌产生碳青酶烯酶，这源于能够产生该酶的碳青霉烯编码基因。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)，新德里金属β-内酰胺酶(NDM)和Oxacillinase-48(OXA-48)产碳青霉烯酶的肠杆菌科中最常见的碳青霉烯酶。这些基因通常由质粒所携带，能够在不同菌体之间进行水平传播，从而导致了耐药性的广泛流行。质粒清除技术是对抗包括CRE在内的多重耐药细菌(MDR)的潜在有效方法，因为它具有从菌体中去除耐药基因而不增加细菌选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)、耐药基因信息挖掘：通过NCBI检索并下载genbank中的所有blaKPC和blaNDM基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临PAM基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点；/n(2)、步骤S1中基因序列与gRNA进行连接：通过人工合成引物和PCR的方法生成靶向的sgRNA基因片段；/n(3)、构建含有上述S1步骤中所述靶向序列的crispr/cas9工具质粒pCureKPC和pCureNDM；/n(4)、更换pCureKPC和pCureNDM质粒的抗性标记；/n(5)、cre菌株的药物敏...

【技术特征摘要】
1.一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、耐药基因信息挖掘：通过NCBI检索并下载genbank中的所有blaKPC和blaNDM基因序列，利用blast对各基因序列分别进行比对，以紧临PAM基序的20个碱基的共有序列作为耐药基因清除的靶点；
(2)、步骤S1中基因序列与gRNA进行连接：通过人工合成引物和PCR的方法生成靶向的sgRNA基因片段；
(3)、构建含有上述S1步骤中所述靶向序列的crispr/cas9工具质粒pCureKPC和pCureNDM；
(4)、更换pCureKPC和pCureNDM质粒的抗性标记；
(5)、cre菌株的药物敏感性试验：利用纸片法和肉汤稀释法对临床分离的肺炎克雷伯菌进行MIC试验；
(6)、耐药质粒的清除和筛选：首先制备产碳青酶烯酶的肠杆菌感受态细菌，根据药物敏感性实验结果，将不同耐药标记的pCureKPC和pCureNDM质粒电转入感受态细菌，加入阿拉伯糖诱导Cas9蛋白的表达过夜，PCR方法筛选清除耐药质粒的菌株，然后利用5％的蔗糖溶液清除crispr/cas9工具质粒，将宿主细菌的质粒清除。


2.根据权利要求1所述的一种清除肠杆菌科细菌中耐药质粒的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝明巨，石晓红，马建萍，董秀涛，郭建壮，马万山，
申请(专利权)人：山东省千佛山医院，
类型：发明
国别省市：山东;37