一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因制造技术

本发明专利技术提供了一种人骨形成蛋白2编码序列，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。本发明专利技术根据大肠杆菌表达系统设计了适合该表达系统的优化的人骨形成蛋白2编码序列，通过优化密码子获得更高的目的蛋白的表达量。本发明专利技术还提供一种大肠杆菌表达系统表达的人骨形成蛋白2纯化方法，通过该纯化方法可得到纯度达到95％以上的本发明专利技术的人骨形成蛋白2。

A gene encoding human bone morphogenetic protein 2 suitable for E.coli Expression

【技术实现步骤摘要】
一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因
本专利技术属于蛋白质或多肽
，具体涉及一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因。
技术介绍
人骨形成蛋白2(rhBMP2)的基因工程制备，最先是美日研究机构利用人骨形成蛋白2天然编码基因用真核细胞系统来做的，表达水平低，成本比较高，规模化生产所需投资和软硬件要求高，国内的研究者往往直接用人骨形成蛋白2转基因的可向骨细胞分化的干细胞和材料复合用于成骨研究。另一人骨形成蛋白2的基因工程的技术路线是利用大肠杆菌来进行，利用天然编码序列就能得到高水平表达，国内外都有相应的研究报道，从成本和、软硬件要求和投资需求方面都有比较优势。由于人骨形成蛋白2天然基因的终止密码子终止能力较弱，我们和德国的研究机构都发现该天然编码基因在大肠杆菌中不能有效地的终止，会产生1/3强比例的比天然人骨形成蛋白2大3kDa左右的产物，且在纯化过程中难于去掉。德国同行的办法是用特殊的表达系统，且在研究中发现人骨形成蛋白2成熟肽的N段是一个肝素结合位点，去掉这个肝素结合位点不影响生物学活性，且因不会被细胞外基质非特异吸附截留，体现出更高的生物活性。也有对人骨形成蛋白2天然基因进行部分优化进行大肠杆菌表达的研究，还有加入胶原结合序列等功能位点进行局部受控缓释的人骨形成蛋白2大肠杆菌基因工程研究。
技术实现思路
为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：第一个目的，本专利技术提供了一种人骨形成蛋白2基因，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。本专利技术人发现了氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的人骨形成蛋白2，为了研究其在大肠杆菌中的表达机理，本专利技术针对大肠杆菌的表达系统密码子的偏好性对人骨形成蛋白2的核苷酸序列进行了优化，使其更适用于大肠杆菌表达系统，设计优化后的人骨形成蛋白2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，将该序列与质粒连接转入大肠杆菌表达系统，结果获得更高的表达量，因此，本专利技术设计的编码人骨形成蛋白2的核苷酸序列适用于大肠杆菌表达载体，能提高人骨形成蛋白2在该载体系统中的蛋白表达量。进一步地，所述人骨形成蛋白2基因具有(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。为了质粒与目的基因连接时限制性内切酶能更精准的进行酶切，而不破坏目的基因序列，在截短型人骨形成蛋白2编码序列前加上了限制性内切酶EcoRI的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，在截短型人骨形成蛋白2编码序列后加上了限制性内切酶HindIII的识别序列，并以碱基A作为间隔序列，其核苷酸如SEQIDNO:2所示。本专利技术的第二个目的在于提供了一种人骨形成蛋白2的制备方法，包括以下步骤：(1)将具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列与质粒载体连接；(2)将步骤(1)制备的质粒转入原核细胞表达载体；(3)将步骤(2)的原核细胞培养于含有抗生素的平板中筛选阳性克隆细胞；(4)抽提阳性克隆细胞的质粒，进行测序判定质粒载体中的目的基因是否正确；(5)将正确表达的阳性细胞扩大培养，收集菌体，分离纯化细胞破碎的上清液，获得人骨形成蛋白2；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。优选地，所述原核细胞表达载体为大肠杆菌BL21(DE3)；所述质粒为pEVT质粒；所述抗生素为氨苄。优选地，所述步骤(4)中的分离纯化采用以下方法：将收集的细胞上清液采用反向层析纯化，再进行阴离子层析，在收集的纯化溶液中加入复性液，复性24h，然后进行阴离子交换层析，最后用分子排阻层析纯化，获得人骨形成蛋白2。优选地，所述反向层析的条件为：分离介质：SOURCE30RPC，洗脱液：pH8.5，6mol/L尿素中含有0～40％异丙醇；所述复性液为：2mol/L尿素溶液中包含0.1％(V/V)TritonX100，1mM还原型谷胱苷肽，1g/L聚乙二醇4000，5％(V/V)甘油，pH8.5；所述阴离子交换层析的条件为：分离介质：SOURCE30Q，洗脱液：pH8.5，1.5mol/L尿素中含有0～1mol/L氯化钠；所述分子排阻层析的条件为：分离介质：Sephacryls100，洗脱液：pH7.5，0.15mol/L氯化钠。通过本专利技术的蛋白纯化方法可得到纯度达到95％以上的本专利技术的rhBMP2，经蛋白含量的测定各批次产量为359～378mg/L。本专利技术的第三个目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术的第四个目的在于提供一种质粒，所述质粒包含具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。优选地，所述质粒为pEVT。本专利技术的第五个目的在于提供如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列在制备促骨细胞分化钙化的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术根据大肠杆菌表达系统设计了适合该表达系统的优化的人骨形成蛋白2编码序列，通过优化密码子获得较高水平的目的蛋白的表达量，没有出现天然基因在大肠杆菌中表达产物不均一的现象。附图说明图1为人骨形成蛋白2重组表达载体的构建过程示意图。图2为人骨形成蛋白2重组蛋白SDS电泳图(1：未诱导表达工程菌；2：诱导表达工程菌；3：分子量Marker本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人骨形成蛋白2基因，其特征在于，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQ ID NO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。/n

【技术特征摘要】
1.一种人骨形成蛋白2基因，其特征在于，所述人骨形成蛋白2的基因具有(a)或(b)结构的核苷酸序列；其中所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2。


2.如权利要求1所述的人骨形成蛋白2基因，其特征在于，所述人骨形成蛋白2基因具有(c)或(d)结构的核苷酸序列；其中所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。


3.一种人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将具有(a)、(b)、(c)或(d)结构的核苷酸序列与质粒载体连接；
(2)将步骤(1)制备的质粒转入原核细胞表达载体；
(3)将步骤(2)的原核细胞培养于含有抗生素的平板中筛选阳性克隆细胞；
(4)抽提阳性克隆细胞的质粒，进行测序判定质粒载体中的目的基因是否正确；
(5)将正确表达的阳性细胞扩大培养，收集菌体，分离纯化细胞破碎的上清液，获得人骨形成蛋白2；
其中，所述(a)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述(b)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:1功能相同能编码人骨形成蛋白2；所述(c)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述(d)的核苷酸序列具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且与SEQIDNO:2功能相同能编码人骨形成蛋白2。


4.如权利要求3所述的人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于，所述原核细胞表达载体为大肠杆菌BL21(DE3)；所述质粒为pEVT质粒；所述抗生素为氨苄。


5.如权利要求3所述的人骨形成蛋白2的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分离纯化采用以下方法：
将收集的细胞上清液采用反向层析纯化，再进行阴离子层析，在收集的纯化溶液中加入复性...

【专利技术属性】
技术研发人员：筴文奎，
申请(专利权)人：珠海深泓鑫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44