一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组人TSG‑6基因、重组人TSG‑6蛋白标准品及其制备方法和应用，本发明专利技术通过对已有的重组人TSG‑6基因进行优化后，克隆至pET‑32a表达载体中并转化至大肠杆菌中，培养后经诱导表达，经表达后的菌体经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG‑6蛋白粗品，再经分离纯化后得到重组人TSG‑6蛋白纯品，然后与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，制备得到所述重组人TSG‑6蛋白标准品；与现有技术相比，本发明专利技术通过密码子优化实现重组人TSG‑6蛋白的高效表达，并实现了重组人TSG‑6蛋白标准品的批量制备，以此为标准可使不同批次测定的重组人TSG‑6蛋白效价检测结果更为可靠可信。

A recombinant human TSG-6 gene, recombinant human TSG-6 protein standard and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumornecrosisfactor-αstimulatedgene6，TSG-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白，是由间充质干细胞或基质细胞(MSCs)对炎症信号的反应产生的，在多种炎症性疾病或类炎症性病理过程中呈高表达。现已知，TSG-6介导了许多免疫调节和组织修复过程，具有抗炎和组织保护作用，是一个正调节的功能蛋白。TSG-6是由TNFAIP6(tumornecrosisfactor-induciblegene6protein，TNFAIP6)基因编码，是Lee等在筛选肿瘤坏死因子α干预的人二倍体FS-4成纤维cDNA文库时发现的一个新基因。TSG-6基因主要是由相邻的两个组件即Link组件和CUB组件组成，其中Link组件负责与信号分子识别，与透明质酸(hyaluronicacid，HA)、硫酸软骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1链等结合，而CUB则作为功能区发挥其生物学作用。TSG-6基因启动子序列中存在激活物蛋白1(AP－1)和核因子白细胞介素(NF-IL6)结合位点，当受到TNF-α、白介素－1(IL-1)等致炎因子刺激后，该基因在成纤维细胞中表达显著增高，因此被认为是一个受TNF-α等炎症因子调节的基因。TSG-6基因位于人染色体2q233，mRNA全长1440bp，其编码的蛋白含有277个氨基酸残基，属于透明质酸结合蛋白家族，具有多种功能，包括抑制中性粒细胞移行，蛋白网络的调控等，是一个由TNF-α诱导的、参与多种炎症反应的基因，在多种炎症性疾病或类似炎症的疾病过程中呈高表达，通过与透明质酸、间α-蛋白酶抑制剂结合，介导炎性细胞的迁移、黏附，参与细胞外基质重塑，调节蛋白酶网络，是一个正调节的功能蛋白，在许多病理及生理过程中，以及炎症反应和组织重塑中扮演重要角色。大量研究表明，TSG-6是一种效果明显的抗炎因子，在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤、瘢痕疙瘩等炎症过程中，TSG-6均能够抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，并且具有抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。在机体遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。而如果炎症反应持续很长时间，程度剧烈，则会对机体有害。虽然TSG-6的研究及其生物学功能得到日益重视，但至今尚未见到该重组蛋白具有抗病毒活性及其大批量制备其标准品的制备方法等报告。本专利技术首次发现，重组人TSG-6(recombinanthumanTSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性。填补了此领域的空白。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用。具体为：对已有的重组人TSG-6基因进行优化后，克隆至pET-32a表达载体中并转化至大肠埃希菌中。经培养后诱导表达；对表达后的菌体进行洗涤、变性和复性，即可得到重组人TSG-6蛋白；再经分离纯化后得到重组人TSG-6蛋白纯品。然后与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，制备得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。本专利技术通过密码子优化实现重组人TSG-6蛋白的高效表达，并实现了重组人TSG-6蛋白标准品的批量制备。同时，本专利技术提供了一种基于rhTSG-6能够保护MDBK细胞，但不限于此种细胞免受VSV病毒，但不限于此种病毒侵害作用的现象作为抗病毒活性检测结果体系，即采用细胞病变抑制法用于体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法。本方法能准确客观地观察与检测TSG-6抗病毒活性，重复性及准确度均高。经本方法验证，rhTSG-6标准品抗VSV病毒的效价高达约1000.00U/mL。采用上述细胞病变抑制法检测rhTSG-6标准品可抑制感染了VSV病毒的细胞发生细胞病变，以此为评价结果的标准，可使不同批次测定的重组人TSG-6蛋白效价检测结果更为可靠可信。本专利技术采取的技术方案为：一种重组人TSG-6基因，所述重组人TSG-6基因的序列如SEQUENCELISTING400〈2〉所示。所述重组人TSG-6基因编码的重组人TSG-6蛋白的氨基酸序列如SEQUENCELISTING400〈3〉所示。其在氨基酸残基序列上删除了N端16个氨基酸残基，该部分序列为信号肽序列，不利于rhTSG-6在原核系统中表达，而本专利技术提供的重组人TSG-6表达量较之前提高了100倍。本专利技术还提供了一种重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)对如SEQUENCELISTING400〈1〉所示的重组人TSG-6基因中AGG、AGA、ATA、CTA、CGA、CGG、CCC和UCG等稀有密码子进行密码子优化，获得如SEQUENCELISTING400〈2〉所示的重组人TSG-6基因，通过优化可提高密码子适应指数，能提高目的蛋白的表达量水平；(2)将步骤(1)所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组人TSG-6重组菌BL21/pET32a-rhTSG-6；(3)将重组人TSG-6重组菌进行放大培养，并经IPTG诱导表达，然后收集菌体；(4)将步骤(3)收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG-6蛋白粗制品；(5)重组人TSG-6蛋白粗品经分离纯化后即可得到重组人TSG-6蛋白纯品；(6)重组人TSG-6蛋白纯品与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。进一步地，步骤(2)中，还包括对LB平板上培养得到的单菌落进行PCR及BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，鉴定结果为阳性即说明重组人TSG-6重组菌构建成功。根据目的基因序列使用PrimerPremier5软件设计首尾引物，所述PCR鉴定时的引物为：F1：GGATCCTGGGGTTTTAAAGATGGC；R1：AAGCTTTTACAGATGACTAAAGCGAC。步骤(3)中，放大培养所用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基；培养至OD值在0.6-0.8，然后经终浓度为1.0mM的IPTG在30℃诱导表达5h。步骤(5)中，所述分离纯化的方法为：将重组人TSG-6蛋白粗品过滤处理后过His-tag亲和层析柱纯化，收集纯化后的重组人TSG-6蛋白透析，然后调节pH至5.0；再经阴离子交换层析柱纯化，即可得到所述重组人TSG-6蛋白。步骤(5)中，所述His-tag亲和层析柱纯化所用的洗脱液为50mMTris-Cl和500mM咪唑组成的混合液，其pH为8.0。步骤(6)中，所述冻干保护剂为终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人TSG-6基因，其特征在于，所述重组人TSG-6基因的序列如SEQUENCELISTING 400〈2〉所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组人TSG-6基因，其特征在于，所述重组人TSG-6基因的序列如SEQUENCELISTING400〈2〉所示。


2.一种如权利要求1所述的重组人TSG-6基因编码的重组人TSG-6蛋白，其特征在于，所述重组人TSG-6蛋白的氨基酸序列如SEQUENCELISTING400〈3〉所示。


3.一种重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)对如SEQUENCELISTING400〈1〉所示的重组人TSG-6基因进行密码子优化，获得如权利要求1所述的重组人TSG-6基因；
(2)将步骤(1)所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组人TSG-6重组菌；
(3)将重组人TSG-6重组菌进行放大培养，并经IPTG诱导表达，然后收集菌体；
(4)将步骤(3)收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG-6蛋白粗制品；
(5)重组人TSG-6蛋白粗品经分离纯化后即可得到重组人TSG-6蛋白纯品；
(6)重组人TSG-6蛋白纯品与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。


4.根据权利要求3所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，还包括对LB平板上培养得到的单菌落进行PCR及Bam...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，何志远，吴博，蒋敏之，夏兵兵，周炜，
申请(专利权)人：芜湖天明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34