猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用。根据猪GADD45a基因全长序列和载体pLEX‑MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX‑MCS连接，构建pLEX‑MCS‑GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX‑MCS‑GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC‑J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC‑J2细胞系。猪GADD45a基因的新用途，用于调控营养吸收代谢。本发明专利技术开拓了猪GADD45a基因的新功能及其在肠道上皮细胞中研究的新方法。

New application of Gadd45a gene and construction and application of high expression cell line

【技术实现步骤摘要】
猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用
本专利技术涉及猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用，属于生物和现代农业
的应用技术。
技术介绍
GADD45a（又叫DDIT1）是生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员之一，是第一个被检出的p53的下游基因，是一个能够识别基因组损伤的重要生物标志物。参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和肿瘤发生发展等，在调控细胞周期、维持基因组稳定性、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动中起重要作用。猪GADD45a基因mRNA有1527bp，有4个外显子，编码序列全长为498bp，编码165个氨基酸，编码约18kD的蛋白。但目前关于猪GADD45a的研究报道甚少。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供猪GADD45a基因的新用途及高表达细胞系的构建和应用。一种高表达猪GADD45a基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：1）、根据猪GADD45a基因全长序列和LentiORFTM-pLEX-MCS载体，简称pLEX-MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；2）从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX-MCS连接，构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；3）采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC-J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。所述步骤2）中构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒的验证：取8×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，然后用脂质体转染pLEX-MCS-GADD45a质粒，48小时后提取蛋白，用Westernblot法检测GADD45a和内参β-actin的表达。将步骤2）获得的重组慢病毒进行鉴定：将重组慢病毒转染密度为70%~80%的293T细胞，48h后用收集细胞，提取总蛋白并用Westernblot法检测目的基因GADD45a和内参β-actin蛋白表达情况。根据所述的构建方法得到的pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，和/或者重组慢病毒，和/或者高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。根据所述的构建方法得到的pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，和/或者重组慢病毒，和/或者高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系的用途，用于调控肠道紧密连接蛋白表达、细胞增殖、脂肪酸吸收，或者线粒体定位。一种猪GADD45a基因的新用途，用于调控营养吸收代谢。本专利技术的有益效果：1）发现了GADD45a基因的新功能和应用，即在营养吸收代谢等过程中的功能和应用；2）建立得到的高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系中高表达猪GADD45a，细胞可多次传代且能保持较好的特性，是研究猪GADD45a功能的一种强有力的细胞模型，开拓了研究猪GADD45a功能及其在肠道上皮细胞中研究的新方法，可广泛用于开展猪细胞的增殖、分化及营养吸收代谢等过程中相关研究。附图说明图1是扩增全长猪GADD45a基因的电泳检测图；图中：M---DNAMarker，1---猪小肠组织cDNA模板扩增结果，2---猪脂肪组织cDNA模板扩增结果，3---猪肌肉组织cDNA模板扩增结果。图2是GADD45a基因全长与LentiORFTM-pLEX-MCS载体双酶切产物连接后得到的超表达载体（pLEX-MCS-G45a）转化后单克隆菌落PCR检测电泳检测图；图中：M---DNAmarker，1~15---单克隆菌落PCR产物电泳结果。图3是pLEX-MCS-G45a测序及BLAST结果。图4是pLEX-MCS-G45a转染293T细胞后GADD45a蛋白表达的Westernblot检测结果；图中：M---蛋白预染MARKER；1~2---转染pLEX-MCS-G45a质粒的293T细胞蛋白；3，未转染质粒的293T细胞蛋白。图5是pLEX-MCS-G45a转染293T细胞后b-actin蛋白表达的Westernblot检测结果；M---蛋白预染MARKER；1~2---转染pLEX-MCS-G45a质粒的293T细胞蛋白；3，未转染质粒的293T细胞蛋白。图6是pLEX-MCS-G45a慢病毒转染293T细胞后Westernblot检测结果；图中：CON---空白对照；OE---pLEX-MCS-G45a慢病毒。图7是pLEX-MCS-G45a慢病毒转染猪IPEC-J2细胞经Puromycin筛选后形成的细胞群落。图8是筛选后得到的高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞后Westernblot检测结果；图中：CON--空白对照;OE---高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系。图9是高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系中紧密连接蛋白Occludin蛋白表达Westernblot检测结果；图中：CON--空白对照;OE---高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系。图10是高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系增殖结晶紫染色检测结果。图11是高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞对Bodipy标记的脂肪酸（FA）吸收检测结果；图中：CON--空白对照;OE---高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系。图12是高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞对线粒体定位的影响检测结果；图中：CON--空白对照;OE---高表达猪GADD45a的IPEC-J2细胞系。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的做进一步阐述。（一）、猪GADD45a基因慢病毒表达载体构建与鉴定1、猪GADD45a基因全长引物设计使用oligo6.0引物软件设计扩增499bp序列的引物。为了便于与pLEX-MCS载体克隆，在引物两端加上XhoI及BamHI的酶切位点。引物序列如下：GADD45a-F：5’-GAGGATCCACTAGTATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCT-3’（斜体为BamHI酶切位点，下划线为起始密码子）；GADD45a-R:5’-CGAGCGGCCGCTCAAGCGTAGTCTGGGACGGTATGGGTACCGTCCGTTCAGGAAGA-3’（斜体为NotI酶切位点，双下划线为终止密码子，下划线为HA标签序列）。2、总RNA的提取取出生一周后小猪，收集其小肠、背最长肌和脂肪，用Trizol法提取总RNA。步骤如下：1）取200mg组织，加入1mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高表达猪GADD45a基因的细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：/n1）、根据猪GADD45a基因全长序列和LentiORF

【技术特征摘要】
1.一种高表达猪GADD45a基因的细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：
1）、根据猪GADD45a基因全长序列和LentiORFTM-pLEX-MCS载体，简称pLEX-MCS，设计并合成含有酶切位点的GADD45a全长的扩增引物；
2）从小猪脂肪组织中扩增得到GADD45a基因全长序列，回收并酶切，与酶切后的pLEX-MCS连接，构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒，单克隆测序鉴定并验证后，采用脂质体转染法将pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒和pSPAX.2及pMD2.G共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒；
3）采用步骤2）获得的重组慢病毒转染猪IPEC-J2细胞，获得高表达猪GADD45a基因的IPEC-J2细胞系。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：所述步骤2）中构建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒质粒的验证：
取8×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，然后用脂质体转染pLEX-MCS-GADD45a质粒，48...

【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，有文静，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33