rhTSG-6荧光定量RT-qPCR检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了rhTSG‑6荧光定量RT‑qPCR检测试剂盒及其应用，基于荧光定量RT‑qPCR法检测在MDBK细胞/VSV体系中的VSV病毒N基因片段核酸拷贝数因受到rhTSG‑6蛋白标准品的抑制作用而减少的现象，以证实rhTSG‑6具有明显抗病毒活性且有剂量依赖性，所述试剂盒包括：rhTSG‑6蛋白标准品、含有VSV N基因片段的重组质粒标准品；RT‑PCR反应液；所述RT‑PCR反应液为：SYBR Premix Ex Taq 10MIU Ⅱ(2×)10μL、10μM上游引物0.8μL、10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL，补无菌水至20μL。利用该试剂盒检测rhTSG‑6抗病毒活性具有简便易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、高稳定性等的特点。

Rhtsg-6 fluorescence quantitative RT-qPCR detection kit and its application

【技术实现步骤摘要】
rhTSG-6荧光定量RT-qPCR检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物检测
，涉及rhTSG-6荧光定量RT-qPCR检测试剂盒及其应用，具体涉及rhTSG-6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒及其在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumornecrosisfactor-αstimulatedgene6，TSG-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白，是由间充质干细胞或基质细胞(MSCs)对炎症信号的反应产生的，在多种炎症性疾病或类炎症性病理过程中呈高表达。现已知，TSG-6介导了许多免疫调节和组织修复过程，具有抗炎和组织保护作用，是一个正调节的功能蛋白。越来越多的研究表明，在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤和瘢痕疙瘩等炎症过程中，TSG-6均具有抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达、抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。本专利技术首次发现，重组人TSG-6(recombinanthumanTSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性。并以此发现研制了rhTS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：rhTSG-6蛋白标准品、含有VSV N基因片段的重组质粒标准品；RT-PCR反应液；/n所述VSV N基因片段的基因序列如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示；/n所述RT-PCR反应液为：SYBR Premix Ex Taq 10MIUⅡ(2×)10μL、10μM上游引物0.8μL、10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL，补无菌水至20μL；/n所述cDNA的制备方法为：以rhTSG-6蛋白标准品溶液作用MDBK细胞24h，再用VSV病毒悬液感染作用后的MDBK细胞，...

【技术特征摘要】
1.一种重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：rhTSG-6蛋白标准品、含有VSVN基因片段的重组质粒标准品；RT-PCR反应液；
所述VSVN基因片段的基因序列如SEQUENCELISTING400〈4〉所示；
所述RT-PCR反应液为：SYBRPremixExTaq10MIUⅡ(2×)10μL、10μM上游引物0.8μL、10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL，补无菌水至20μL；
所述cDNA的制备方法为：以rhTSG-6蛋白标准品溶液作用MDBK细胞24h，再用VSV病毒悬液感染作用后的MDBK细胞，提取这些感染细胞的总RNA，再经逆转录后得到cDNA。


2.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，
所述上游引物为：5’-CGGAATAAACATCGGGAAAG-3’；
所述下游引物为：5’-CCAAGTAGATACAAAGGCAACC-3’。


3.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述VSV病毒的病毒悬液的滴度为100TCID50/0.1mL；VSV病毒感染作用后的MDBK细胞的时间为24h。


4.根据权利要求1-3任意一项所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有VSVN基因片段的重组质粒标准品的制备方法包括以下步骤：
(1)使用上游引物和下游引物，利用RT-PCR方法从VSV病毒扩增出VSVN基因片段；
(2)将VSVN基因片段连接至pMD18T载体上，构建的重组质粒pMD18T-VSVN；
(3)将重组质粒pMD18T-VSVN转化至大肠埃希菌DH5α，在含100μg/mLAmp的LB培养基中增殖，裂解法提取，经试剂盒纯化，即可得到含有VSVN基因片段的重组质粒标准品。


5.根据权利要求4所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，所述RT-PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，夏兵兵，吴博，周炜，何志远，蒋敏之，
申请(专利权)人：芜湖天明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34