基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法及试剂盒技术

本申请提供了基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，包括从孕妇外周血浆中获得总DNA，选择包含母胎甲基化差异基因位点序列和内参基因序列设计引物和探针；进行甲基化敏感限制性内切酶消化处理；在数字PCR装置中对包含母胎甲基化差异的基因位点序列和内参基因序列进行PCR扩增，检测荧光信号，得到母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数，并排除酶切不完全导致的母源性游离DNA假阳性干扰。本申请通过甲基化敏感性限制性内切酶‑PCR法和数字PCR平台结合，利用母胎甲基化差异基因作为标志物检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数，有利于准确、快速地对妊娠妇女进行早期无创产前筛查或产前诊断。

Method and kit for detecting absolute copy number of fetal free DNA in maternal plasma based on digital PCR

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法及试剂盒
本申请涉及涉及数字PCR
，尤其涉及一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA拷贝数的方法及试剂盒。
技术介绍
对妊娠妇女进行的无创产前筛查和产前诊断检查过程中，往往需要掌握胎儿游离DNA在母体血浆中的拷贝数。目前已有的测量胎儿游离DNA在母体血浆中的拷贝数的方法，包括Y染色体估算法、基于SNP的胎儿特异SNP位点法、基于SNP的深度靶向测序法、基于SNP的低深度测序、基于核小体印迹法等等。但现有技术中的这些方法，均存在某些方面的劣势，例如不适合女胎、对测序深度要求非常高、准确性差等，并且通过现有方法难以准确获得母体血浆中胎儿游离DNA的绝对拷贝数。尤其当胎儿游离DNA在母体血浆中的浓度较低时，各种已知方法的检测结果之间还存在较大差异。因此本领域迫切需要开发一种检测母体血浆中胎儿游离DNA拷贝数的方法，用于早期、安全无创、准确、快速、合适对妊娠妇女进行无创产前筛查和产前诊断。
技术实现思路
鉴于
技术介绍
中存在的问题，本申请的目的在于提供一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA拷贝数的方法及试剂盒，以准确、快速地对妊娠妇女进行早期的无创产前筛查或产前诊断。为了达到上述目的，本申请的第一方面提供了一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，至少包括如下步骤：(1)从孕妇外周血浆中获得总DNA，作为待测基因组DNA；(2)选择包含母胎甲基化差异的基因位点序列，设计扩增引物和探针引物；(3)选择包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列，设计扩增引物和探针引物，所述内参基因包含步骤(2)中的母胎甲基化差异基因的相同酶切位点；(4)对步骤(1)所述的待测基因组DNA进行甲基化敏感限制性内切酶消化处理；(5)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(2)中所述的扩增引物和探针引物，对含母胎甲基化差异基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，得到母胎甲基化差异基因的拷贝数，即为母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数；(6)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(3)中所述的扩增引物和探针引物，对所述包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，排除因酶切不完全导致的母源性游离DNA的假阳性干扰。进一步地，数字PCR装置中，母胎甲基化差异基因标记得到的阳性点数，即为孕妇外周血浆样本中胎儿游离DNA的数量；当非母胎甲基化差异基因标记得到阳性点数，表明消化处理不完全；当非母胎甲基化差异基因标记得到无阳性点数，表明消化处理完全。上述基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法中，步骤(1)中从孕妇外周血浆中获得总DNA的方法包括且不限于乙醇沉淀法、吸附柱法或磁珠法等常规方法。步骤(2)中所述的扩增引物包括一对核酸扩增引物，所述核酸扩增引物能够退火并在此扩增位点侧翼区，所述位点包含至少一个母胎甲基化差异的酶切位点。步骤(2)中所述的探针引物包括一种引物或探针，以检测至少一个母胎甲基化差异的序列。另外，所述内参基因为包含步骤(2)中相同酶切位点的非母胎甲基化差异的基因，包含但不限于管家基因、单拷贝基因等。步骤(3)中的扩增引物包含但不限于一对核酸扩增引物，该核酸扩增引物能够退火并在此扩增位点侧翼区，该位点包含至少一个与步骤(2)中相同酶切位点。步骤(3)中的探针引物包含但不限于一种引物或探针，以便检测至少一个非母胎甲基化差异的序列。本申请实施方式中所使用的PCR装置对液滴的分割方式包含但不限于“油包水”的微滴生成方式、“物理分割”的微滴生成方式、“毛细管分割”的微滴生成方式、“振动注射”的微滴生成方式等微滴生成方式。优选地，所述母胎甲基化差异基因包括NKX2-3、EGR、RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEEFF2、PYCARD中的至少一种。其中，NKX2-3为本申请首次发现的母胎甲基化差异基因；EGR、RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEEFF2、PYCARD为已知的母胎甲基化差异基因。优选地，所述甲基化敏感限制性内切酶包括AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、EagI、FauI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TspMI、ZraI中的至少一种。优选地，所述母胎甲基化差异基因为NKX2-3基因，对包含NKX2-3基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。优选地，所述内参基因为ACTB基因，对包含内参ACTB基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。优选地，所述PCR扩增反应体系组成为：10×dPCRBufferMix3.5μl，上、下游引物各1μl，探针引物1μl，基因组DNA模板1.5μl，加水至35μl；所述PCR扩增反应程序为：90℃预变性10min后进入PCR循环，95℃20s，60℃40s，45个循环，对PCR扩增产物进行荧光检测。本申请的第二方面提供一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的试剂盒，至少包括对含母胎甲基化差异基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针，以及对含非母胎甲基化差异内参基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针。优选地，在本申请所提供的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的试剂盒中，所述母胎甲基化差异基因为NKX2-3基因，对包含NKX2-3基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团；所述内参基因为ACTB基因，对包含内参ACTB基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：/n(1)从孕妇外周血浆中获得总DNA，作为待测基因组DNA；/n(2)选择包含母胎甲基化差异的基因位点序列，设计扩增引物和探针引物；/n(3)选择包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列，设计扩增引物和探针引物，所述内参基因包含步骤(2)中的母胎甲基化差异基因的相同酶切位点；/n(4)对步骤(1)所述的待测基因组DNA进行甲基化敏感限制性内切酶消化处理；/n(5)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(2)中所述的扩增引物和探针引物，对含母胎甲基化差异的基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，得到母胎甲基化差异基因的拷贝数，即为母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数；/n(6)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(3)中所述的扩增引物和探针引物，对所述包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，排除酶切不完全导致的母源性游离DNA的假阳性干扰。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
(1)从孕妇外周血浆中获得总DNA，作为待测基因组DNA；
(2)选择包含母胎甲基化差异的基因位点序列，设计扩增引物和探针引物；
(3)选择包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列，设计扩增引物和探针引物，所述内参基因包含步骤(2)中的母胎甲基化差异基因的相同酶切位点；
(4)对步骤(1)所述的待测基因组DNA进行甲基化敏感限制性内切酶消化处理；
(5)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(2)中所述的扩增引物和探针引物，对含母胎甲基化差异的基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，得到母胎甲基化差异基因的拷贝数，即为母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数；
(6)在数字PCR装置中，以酶切后的基因组DNA为模板，采用步骤(3)中所述的扩增引物和探针引物，对所述包含非母胎甲基化差异的内参基因位点序列进行PCR扩增，检测荧光信号，排除酶切不完全导致的母源性游离DNA的假阳性干扰。


2.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，
母胎甲基化差异基因标记得到的阳性点数，即为孕妇外周血浆样本中胎儿游离DNA的数量；
非母胎甲基化差异基因标记得到阳性点数，表明消化处理不完全；
非母胎甲基化差异基因标记得到无阳性点数，表明消化处理完全。


3.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于：所述母胎甲基化差异基因包括NKX2-3、EGR、RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEEFF2、PYCARD中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶包括AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、EagI、FauI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TspMI、ZraI中的至少一种。


5.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，所述母胎甲基化差异基因为NKX2-3基因，对包含NKX2-3基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：
上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。


6.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因，对包含内参ACTB基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：
上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。


7.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的方法，其特征在于，
所述PCR扩增反应体系组成为：10×dPCRBufferMix3.5μl，上、下游引物各1μl，探针引物1μl，基因组DNA模板1.5μl，加水至35μl；
所述PCR扩增反应程序为：90℃预变性10min后进入PCR循环，95℃20s，60℃40s，45个循环，对PCR扩增产物进行荧光检测。


8.一种基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的试剂盒，其特征在于，至少包括对含母胎甲基化差异基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针，以及对含非母胎甲基化差异内参基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针。


9.根据权利要求8所述的基于数字PCR检测母体血浆中胎儿游离DNA绝对拷贝数的试剂盒，其特征在于，
所述母胎甲基化差异基因为NKX2-3基因，对包含NKX2-3基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团；
所述内参基因为ACTB基因，对包含内参ACTB基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，其中，探针引物的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。


10.一种基于数字PCR检测胎儿RhD血型基因的试剂盒，其特征在于，至少包括：
对NKX2-3基因序列进行扩增和检测的引物及探针；
对内参ACTB基因序列进行扩增和检测的引物及探针；
对RhD基因外显子7序列进行扩增和检测的引物及探针；
对RhD基因外显子10序列进行扩增和检测的引物及探针；
对RhD基因内含子4序列进行扩增和检测的引物及探针。


11.根据权利要求10所述的基于数字PCR检测胎儿RhD血型基因的试剂盒，其特征在于：
对NKX2-3基因位点序列进行扩增和检测的引物及探针为：
上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，探针引物的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈燕龙，梁军，景奉香，吴东平，
申请(专利权)人：江苏圣极基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32