一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术提供了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，该探针核苷酸序列为5’‑AGATGGTTCTGCTATCGCTTT‑3’；SEQ ID NO.1。与现有技术相比，本发明专利技术取得的有益效果为：解决了国外设计的禽类粪便污染物标记物无法在我国进行使用的现状，提供了一种适宜中国使用、灵敏度高、特异性好的禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针。本发明专利技术设计的探针灵敏度达到了86.55％，特异性达到了93.48％。

A fluorescent quantitative PCR detection probe and detection method for poultry feces pollution

【技术实现步骤摘要】
一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法
本专利技术涉及生物检测
，更具体的说是涉及一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法。
技术介绍
随着禽类养殖业的繁荣发展，禽类粪便的产生日益增加。部分粪便因雨水冲刷或人为管理不善，将会流入地表水中，对水体环境造成一定的污染。粪便中含有大量对人体有害的病原微生物，能够引起腹泻和急性肠胃炎等疾病。许多粪源病原体可以在体外环境水体中大量生长繁殖，从而导致病原微生物的水源性传播。如何快速鉴别水体中是否存在禽类粪便污染，对水体管理和保护具有重要的指导意义。微生物溯源是根据源指示微生物与宿主之间所具有的特异性关系来定位污染源的一类溯源技术。微生物溯源技术以其客观性、低成本、检测速度快和结果准确等受到普遍关注。但是目前该项技术的应用存在地区差异性，这主要是两方面原因造成的：(1)宿主方面，由于不同地区的畜禽饲养方式往往存在一定差异，微生物在适应不同地区的宿主肠道环境的过程中可能产生遗传多样性，进而使得微生物溯源指示物的表型或基因型发生变异；(2)环境因素方面，由于指示物在不同环境条件下的衰减速率不一样，加之环境水体成分的复杂性，使微生物溯源技术在不同地区的适应性存在差异。目前，大多数禽类粪便污染标记物均是在国外专利技术的，故这些标记物不适合在中国使用。因此，提供一种适宜中国使用、灵敏度高、特异性好的禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，所述探针命名为AV4143P1，核苷酸序列为5’-AGATGGTTCTGCTATCGCTTT-3’；SEQIDNO.1。优选的，所述5’端使用6FAM作为荧光基团，所述3’端使用BHQ1作为淬灭基团。一种检测水体中禽类粪便污染的方法，包括如下步骤：(1)提取样本DNA；(2)采用荧光定量PCR方法进行检测；反应体系如下：10μL2XTaqManEnvironmentalMasterMix2.0(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)、终浓度为500nM的上游引物AV4143F、终浓度为500nM的下游引物AV4143R、终浓度为250nM的AV4143P1、2μL的DNA模板，加无菌水至20μL；所述上游引物AV4143F的核苷酸序列为5’-TGCAAGTCGAACGAGGATTTCT-3’；SEQIDNO.2；所述下游引物AV4143R的核苷酸序列为5’-TCACCTTGGTAGGCCGTTACC-3’；SEQIDNO.3。优选的，反应条件如下：50℃预变性2min；95℃预变性10min；95℃变性15s；60℃退火和延伸1min，共40个循环。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：解决了国外设计的禽类粪便污染物标记物无法在我国进行使用的现状，提供了一种适宜中国使用、灵敏度高、特异性好的禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针。本专利技术涉及的探针灵敏度达到了86.55％，特异性达到了93.48％。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术实施例1中14条序列进行ClustalW比对结果图；图2附图为本专利技术实施例2中AV4143P1的标准曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1AV4143P1探针的构建(1)样品采集为使样品具有代表性，共在内蒙古、北京、河南、江西和广东全国5个地区采集了共计162份样品，包括119份禽类污染来源样品和43份非禽类污染样品。①119个禽污染来源样品，包括14个禽垫草样品、75个鸡粪便样品、10个鸭粪便样品、14个鹅粪便样品和6个鸽子粪便样品。②43个非禽类来源样品，包括10个猪粪便样品、6个狗粪便样品、6个马粪便样品、5个驴粪便样品、6个牛粪便样品、5个山羊粪便样品和5个绵羊粪便样品。采集样品完成后，使用干冰将样品尽快运送回实验室，并保存于-80℃冰箱内。(2)DNA的提取①取180-220mg样品，按照说明书要求使用QIAampDNAStoolMiniKit(QIAGEN,Hilden,Germany)DNA提取试剂盒提取样品DNA。②然后使用试剂盒OneStepTMPCRInhibitorRemovalKit(ZymoResearchCorps,Irvine,CA,USA)去除得到的DNA中的抑制剂。③最后使用NaNodrop2000spectrophotometer(ThermoFisherTechnologies,FosterCity,CA,USA)测定得到的DNA的浓度。(3)测序①使用引物对AV4143F和AV4143R对步骤(2)提取的3个鸡粪便DNA样品进行常规PCR实验，AV4143F的核苷酸序列为5’-TGCAAGTCGAACGAGGATTTCT-3’；SEQIDNO.2，AV4143R的核苷酸序列为5’-TCACCTTGGTAGGCCGTTACC-3’；SEQIDNO.3。反应体系如下：5μL10XExTaqBuffer(Mg2+plus)(TakaraBio,Otsu,Japan),4μLdNTPMixture(各2.5Mm),终浓度为500nM的上游引物AV4143F、终浓度为500nM的下游引物AV4143R,0.25μLTakaraExTaq(5U/μL),2μL的DNA模板，加无菌水至50μL。反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min。得到目的片段。②将目的片段使用1％的琼脂糖在恒压100V，电泳时间40min的条件下进行电泳，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化目的片段。③将纯化后的目的片段插入到pUCm-T质粒载体中，将重组质粒导入到大肠杆菌感受态细胞Top10中过夜培养。④培养后的重组载体使用T载体PCR产物克隆试剂盒提取，然后将阳性克隆子使用引物对M13F/R进行双向测序，其中M13F的核苷酸序列为：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG-3’；SEQIDNO.4；M13R的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述探针命名为AV4143P1，核苷酸序列为5’-AGATGGTTCTGCTATCGCTTT-3’；SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述探针命名为AV4143P1，核苷酸序列为5’-AGATGGTTCTGCTATCGCTTT-3’；SEQIDNO.1。


2.如权利要求1所述的一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述5’端使用6FAM作为荧光基团，所述3’端使用BHQ1作为淬灭基团。


3.一种利用权利要求1所述探针检测禽类粪便污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)采用荧光定量PCR方法进行检测；
反应体系如下：
10μL2XTaqManEnvironmentalMasterMix2...

【专利技术属性】
技术研发人员：余志晟，梁红霞，张洪勋，刘如铟，
申请(专利权)人：中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京;11