一种HBV基因组扩增的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种HBV基因组扩增的研究方法，包括miR‑146a调控HBV基因组扩增的研究过程和Ago2作为载体协同miR‑146a调控HBV基因组扩增的研究过程，通过上述研究方法，在HBV扩增感染中发现并证实了一种新的miR‑146a→FEN1→HBV DNA调节轴，该调节轴对HBV基因组扩增提供了必要条件，进一步说明了HBV DNA复制的具体分子机制，为理解HBV发病机制并开拓新的治愈靶点及方案提供理论依据；为今后深入细致的研究可彻底阐明HBV复制的分子机制，并为清除细胞内cccDNA库，完全阻断HBV复制这一治愈目标创造了条件。

A study method of HBV genome amplification

【技术实现步骤摘要】
一种HBV基因组扩增的研究方法
本专利技术涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种HBV基因组扩增的研究方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)简称乙肝病毒，属嗜肝双链DNA病毒，HBV基因组在宿主细胞中可合成共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular，cccDNA)，作为乙肝病毒扩增模板稳定的存在，同时也是HBV持续感染的关键因素；HBV病毒与慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等多种疾病相关，据估计，全球有3.5-4亿人感染HBV,每年有50万～120万人死于HBV感染导致的肝衰竭、肝硬化、原发性肝癌等肝脏疾病；目前，HBV的致病机制尚不完全清楚，在其扩增周期中，HBVcccDNA作为一个独特的扩增中间体，是乙肝病毒扩增水平最特异的指标，它既能转录产生3.5kb前基因组mRNA，又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的病毒蛋白，然而HBVcccDNA并不通过类似半保留扩增的方式进行自主扩增，而是由rcDNA这一逆转录产物转变而成，这种特殊逆转录形式对HBVDNA的扩增至关重要；然而，现有抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV基因组扩增的研究方法，其特征在于，该研究方法的具体步骤包括：/n步骤一：通过miR-146a调控HBV基因组扩增的研究，得到miR-146a通过下游靶基因IRAK1/TRAF6调控FEN1蛋白基因的转录，从而促进HBV扩增；/n步骤二：在步骤一的基础上，利用Ago2作为载体协同miR-146a调控HBV基因组扩增的研究，得到并证实了一种新的miR-146a→FEN1→HBV DNA调节轴。/n

【技术特征摘要】
1.一种HBV基因组扩增的研究方法，其特征在于，该研究方法的具体步骤包括：
步骤一：通过miR-146a调控HBV基因组扩增的研究，得到miR-146a通过下游靶基因IRAK1/TRAF6调控FEN1蛋白基因的转录，从而促进HBV扩增；
步骤二：在步骤一的基础上，利用Ago2作为载体协同miR-146a调控HBV基因组扩增的研究，得到并证实了一种新的miR-146a→FEN1→HBVDNA调节轴。


2.根据权利要求1所述的一种HBV基因组扩增的研究方法，其特征在于：步骤一所述的miR-146a调控HBV基因组扩增的研究的具体步骤包括：
S1.在HepG2细胞系和HBV稳定扩增细胞系HepG2.2.15中，采用逆转录定量PCR技术检测miR-146a在亲本细胞HepG2和HBV稳定扩增细胞系HepG2.2.15细胞中的表达水平差异；
S2.在HepG2.2.15细胞中分别转染miR-146amimic和miR-146ainhibitor，48小时后，采用实时定量PCR方法检测HBVDNA的表达水平，westernblot方法检测结构特异性核酸内切酶的表达水平；
S3.提取HBV扩增中间体，将步骤S2经miR-146amimic和miR-146ainhibitor转染后的HepG2.2.15分别收集后，加入HBV病毒核心颗粒DNA提取液400ul，37℃孵育15min，15000g×，离心3min后，将上清转移至新EP管中，加入PEG8000200ul冰上静置40min，12000g×，4℃离心7min，弃去上清加入消化液400ul、蛋白酶K15ul，45℃消化过夜；酚氯仿抽提DNA，利用异丙醇和乙醇对其进行沉淀，定容HBVDNA；
S4.实时定量PCR检测，以上述S3样本为模板，利用UltraSYBRGreen试剂盒说明书配置标准PCR反应体系，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环，进行溶解曲线分析；
S5.Westernblot检测，利用RIPA蛋白提取试剂裂解上述步骤S2的HepG2.2.15细胞，沉淀提取总蛋白，12000g×，离心3min，收集上清；将提取的总蛋白在12％SDS-PAGE的缓冲液中电泳，电转至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭3h，分别加入小鼠抗人FEN1、鼠抗人Ago2和鼠抗β-actin单抗，4℃过夜，利用TBST缓冲溶液洗膜后，再加入抗鼠IgG，利用TBST缓冲溶液洗膜后，ECL试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影；
S6.在步骤S2所述的HepG2.2.15细胞中外源性转入FEN1质粒，48小时后分别检测HBVDNA载量以及miR-146a水平；
S7.在步骤S2所述的HepG2.2.15细胞中分别转染miR-146amimic和miR-146ainhibitor后，利用生物信息学软件筛选分析miR-146a的下游潜在靶基因IRAK1和TRAF6，采用逆转录定量PCR技术检测IRAK1和TRAF6的表达水平。


3.根据权利要求2述的一种HBV基因组扩增的研究方法，其特征在于：经miR-146a调控HBV基因组扩增的研究得到：
(1)miR-146a可以促进HBV基因组的扩增和表达；
(2)miR-146a能促进FEN1扩增和翻译，同时FEN1可促进miR-146a水平和HBV-DNA扩增；
(3)miR-146a可以抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘万龙，
申请(专利权)人：川北医学院，
类型：发明
国别省市：四川;51