一种校准实时荧光定量PCR仪的方法技术

本发明专利技术涉及生物分析领域。一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，包括如下步骤：配制未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；将鸭源性IL‑2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r；其中所述鸭源性IL‑2基因DNA标准物质含有鸭源性基因组DNA。

A method of calibrating real-time fluorescent quantitative PCR instrument

【技术实现步骤摘要】
一种校准实时荧光定量PCR仪的方法
本专利技术涉及生物分析领域，尤其涉及一种校准实时荧光定量PCR仪的方法。
技术介绍
肉和肉制品是人类生活的重要营养来源，随着人们生活水平的提高，对其需求量也越来越大。但近几年来，国内外一些不法分子在经济利益的驱使下大肆掺杂使假，将相对廉价的鸡鸭等肉类经深加工后冒充牛羊肉进行销售，不仅侵犯了消费者的合法权益，也严重损害了本国的国际声誉。因此，肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。然而，由于动物源性基因组DNA标准物质在国内外仍没有系统的研制单位，使得监管和检测都缺乏依据。近年来，市场上出现以鸭肉冒充牛羊肉掺假的现象较为普遍。肉和肉制品是人类生活的重要营养来源。近年来，在经济利益的驱使下，我国一些不法分子为牟取暴利，大肆掺杂使假，将相对廉价的鸡鸭等肉类经深加工后冒充牛羊肉进行销售，不仅侵犯了消费者的合法权益，而且严重损害了我国出口牛羊产品的国际声誉。在欧盟国家，马肉的价格约为牛肉的三分之一，有些供应商就以马肉充当牛肉来获得更高利润。2013年1月欧盟爆发的“马肉风波”将多个欧洲国家卷入丑闻中，引起涉事国家的轩然大波，引发消费者反感。因此，肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。因此建立准确、可靠的肉类鉴别方法具有重要的经济价值和深远的社会意义。但目前由于在监管和检测体系中缺乏动物源性标准物质，使得监管检测的结果缺乏量值的溯源性。物种鉴别的传统方法主要包括解剖学、组织学、感官判断、化学方法、电泳法、色谱法和免疫学等方法。在传统的鉴别方法中：由于动物生理结构及组份的相似性，解剖学、组织学和感官判断等方法具有较大的局限性；化学法既费时又费力，而且很难检测微量样品；色谱法样品处理环节多，对硬件和软件均具有较高的要求；所以电泳法和免疫学方法的应用最为广泛。即便如此，在电泳法中，由于蛋白的上样量、样品的新鲜程度、动物的年龄和性别、剩余血量、热处理的程度和染色技术均会影响蛋白的电泳速度，灵敏度低和可重复性差成为限制该技术用于检测肉类物种的最大障碍。而免疫学检测技术的核心在于抗原和抗体两个层面：(1)热处理后蛋白质发生变性，引起抗原决定簇的改变和蛋白溶解度的降低，常导致交叉反应和检测灵敏度的降低。(2)免疫学方法的成功与否依赖于所用抗体的质量，而双抗体夹心法需要两个匹配的抗原决定簇，这对抗体的特异性和灵敏性提出了更高的要求。因此，免疫学检测方法存在特异性较低、受样品基质影响大、易产生假阳性结果的局限。综上，这些传统鉴别方法都有一定的局限性。随着分子生物学技术的发展，核酸水平的检测逐渐得到广泛认可。核酸具有遗传信息丰富、理化性质稳定(热稳定性与酸碱稳定性均优于蛋白质)、体内广泛存在等优点，将动物种属间的差异遗传信息作为物种鉴别的检测靶点，再结合具有强特异性、高灵敏度、操作简单快速和低成本等优点的PCR技术，以DNA检测为基础的肉类及肉制品物种鉴别技术具有特异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，其检测精度可达属与亚属水平，已成为食品中动物源性真实性鉴别与溯源性分析技术的主流方法。但目前，动物源的核酸检测，由于缺乏可用的标准物质，使得检测缺乏重复性、可比性和溯源性。近年来，我国的动物源性检测技术方法和标准化工作进展迅速，制订了一系列动物源性产品检测技术标准，而动物源性标准物质在动物产品造假检测、安全监管、定性与定量检测、检测方法建立与标准化过程中是不可或缺的物质基础。同时我国肉类进口近几年来逐年增加，2018年进口总量达到421.7万吨。而由于相应标准物质的缺乏，对于产品的身份验证、进出口检验、企业自控和国际贸易互认带来了一定的影响。应用可靠的标准物质是得到高质量分析测定数据的保证。建立动物源性标准物质研制与生产技术平台是我国动物食品安全监管的基本要求。为了对动物源性产品进行有效的安全监管，原则上，每种动物源性都必须研制对应的标准物质，保障动物产品的检测、监测和溯源。但现阶段，国内外动物源性标准物质缺乏已经严重影响动物源性检测技术的标准化和已有标准的采用。我们查阅了COMAR库、欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(InstituteforReferenceMaterialsandMeasurements，IRMM)、美国石油化学家学会(AmericanOilChemists’Society,AOCS)等著名的标准物质相关国际组织与机构以及国内的标准物质网等，都未查到有证的动物源性基因组DNA标准物质
技术实现思路
为此，本专利技术进行了鸭源性IL-2基因DNA标准物质的研发和制备，可有效提高动物源性产品检测结果的可比性、有效性和溯源性，实现动物源性产品成分分析中的量值传递。本专利技术通过对鸭源性IL-2基因DNA鉴定方法的建立和基因组DNA的制备获得标准物质。经均匀性检验和稳定性检验结果表明，本专利技术标准物质的均匀性良好，在4℃保存可稳定14天，需冷链运输，可冻融10次。在-20℃下可稳定保存达到6个月。本专利技术标准物质的特性量值为基因组DNA拷贝数，标准物质认定结果用标准值±扩展不确定度的方式依次表示为：(5.78±0.51)×103copies/μL。本专利技术标准物质每管100μL，使用时取样量为2μL，可用于鸭源性的定性和定量检测，还可用于PCR仪的校准、DNA定量方法的验证和实验室质量控制等领域。一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，包括如下步骤：配制未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；将鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r；其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质含有鸭源性基因组DNA。作为优选，所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质为多个浓度梯度稀释的形式。作为优选，基因拷贝数为5.78×103拷贝/μl，扩展不确定度为0.51×103拷贝/μl，-20±2℃可稳定保存6个月以上，冻融10次仍可保持稳定，且产品均匀度良好，符合标准物质的要求。作为优选，其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质的制备方法，包括如下步骤：鸭肉前处理；基因组DNA提取、质量鉴定；分装保存；均匀性评估、稳定性评估、定值及不确定度评估，从而得到所述标准物质。作为优选，其中鸭肉前处理是对鸭腿肉进行匀浆，得到的匀浆液用于提取基因组DNA；采用动物组织大提试剂盒进行基因组DNA提取。作为优选，其中动物组织大提试剂盒采用杭州新景生物试剂开发有限公司的动物组织大提试剂盒，具体步骤如下：将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL56℃预热的BufferAT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来；将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；加入2mLBufferSL，旋涡振荡15秒；将离心管置于70℃水浴15min；加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀；将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min；弃50mL离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，其特征在于包括如下步骤：/n配制未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；/n将鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r；/n其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质含有鸭源性基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，其特征在于包括如下步骤：
配制未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；
将鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r；
其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质含有鸭源性基因组DNA。


2.根据权利要求1的方法，其特征在于其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质为多个浓度梯度稀释的形式。


3.根据权利要求1的方法，其特征在于基因拷贝数为5.78×103拷贝/μl，扩展不确定度为0.51×103拷贝/μl，-20±2℃可稳定保存6个月以上，冻融10次仍可保持稳定，且产品均匀度良好，符合标准物质的要求。


4.权利要求1或2或3的方法，其特征在于其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质的制备方法，包括如下步骤：鸭肉前处理；基因组DNA提取、质量鉴定；分装保存；均匀性评估、稳定性评估、定值及不确定度评估，从而得到所述标准物质。


5.根据权利要求4的方法，其特征在于其中鸭肉前处理是对鸭腿肉进行匀浆，得到的匀浆液用于提取基因组DNA；采用动物组织大提试剂盒进行基因组DNA提取。


6.根据权利要求5的方法，其特征在于其中动物组织大提试剂盒采用杭州新景生物试剂开发有限公司的动物组织大提试剂盒，具体步骤如下：
将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL56℃预热的BufferAT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来；
将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；
加入2mLBufferSL，旋涡振荡15秒；将离心管置于70℃水浴15min；
加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀；
将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min；
弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，在核酸纯化柱中加入5mLBufferWB，盖上盖子，≥4500rpm离心2min；
弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，最高速离心5min；
弃50...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈笑芸，徐晓丽，徐俊锋，汪小福，缪青梅，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33