耐碱性提高的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和使用该抗体吸附剂分离抗体的方法技术

本发明专利技术涉及耐碱性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、将该蛋白质固定于载体而得的抗体的吸附剂、以及使用该吸附剂分离抗体的方法。

Fc binding protein with improved alkali resistance, manufacturing method of the protein, antibody adsorbent using the protein and method of antibody separation using the antibody adsorbent

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】耐碱性提高的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和使用该抗体吸附剂分离抗体的方法
本专利技术涉及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质。更详细而言，本专利技术涉及与天然型相比对碱的稳定性(耐碱性)提高的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、将该蛋白质固定于不溶性载体而得到的抗体吸附剂、和使用该抗体吸附剂分离抗体的方法。另外，本专利技术涉及一种Fc结合性蛋白质，其通过将人FcγRIIIa中的特定位置的氨基酸残基置换为其它特定的氨基酸残基而提高了利用基因重组体的生产率。
技术介绍
Fc受体为与免疫球蛋白分子的Fc区结合的一组分子。各个分子通过Fc受体上的识别结构域基于属于免疫球蛋白超家族的识别结构域识别单个或同一组中的免疫球蛋白同种型。由此决定在免疫应答中动员哪种辅助细胞。Fc受体可以进一步分为几种亚型，有针对IgG(免疫球蛋白G)的受体即Fcγ受体、与IgE的Fc区结合的Fcε受体、与IgA的Fc区结合的Fcα受体等。另外，各受体可以进一步进行细分，据报道Fcγ受体存在有FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa、FcγRIIIb(非专利文献1)。Fcγ受体中的FcγRIIIa存在于自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞等细胞的表面，是参与在人免疫机制中也较重要的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性的重要受体。关于该FcγRIIIa与人IgG的亲和性，据报道表示结合强度的结合常数(ka)为107M-1以下(非专利文献2)。另外，已知抗体的糖链结构不同则FcγRIIIa与抗体的结合性也不同(非专利文献3)。在UniProt(登录号：P08637)等公共数据库中，公布了天然型的人FcγRIIIa的氨基酸序列(序列号1)。另外，也同样地公布了人FcγRIIIa的结构上的功能结构域、用于跨过细胞膜的信号肽序列、细胞膜贯穿区域的位置。图1示出了人FcγRIIIa的结构简图。需要说明的是，图1中的编号表示氨基酸编号，该编号对应于序列号1中记载的氨基酸编号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信号序列(S)，第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为细胞外区域(EC)，第209位的缬氨酸(Val)至第229位的缬氨酸(Val)为止为细胞膜贯穿区域(TM)，以及、第230位的赖氨酸(Lys)至第254位的赖氨酸(Lys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知FcγRIIIa对于IgG1至IgG4为止的人IgG亚类、特别是与IgG1和IgG3强结合，而与IgG2和IgG4的结合弱。抗体的糖链结构极大地关系着抗体药物的药效和稳定性，因此制造抗体药物时糖链结构的控制极为重要。FcγRIIIa识别抗体的糖链结构，因此将FcγRIIIa固定于不溶性载体而得到的吸附剂可以通过基于抗体的糖链结构的结合性差异来分离抗体(专利文献2和3)。因此，上述吸附剂在制造抗体药物时的工序分析、分取中是有用的。但是，在欲使用上述吸附剂进行抗体药物的工业化制造时，由于天然型的FcγRIIIa不具有耐碱性而难以通过碱洗涤实现上述吸附剂的再利用，因此不适合于上述工业化制造用途。专利文献1公开了一种Fc结合性蛋白质，其通过将天然型的FcγRIIIa的细胞外区域的氨基酸残基中的特定位置的氨基酸残基置换为其它的氨基酸残基，从而提高了耐碱性。但是，即使是专利文献1中公开的Fc结合性蛋白质，也难以说耐碱性充分，在用于抗体药物的工业化制造用途时，在制造成本方面存在课题。需要说明的是，人FcγRIIIa存在基因多态性，即序列号1中的第176位的氨基酸为苯丙氨酸的类型(序列号1的形态)和为缬氨酸的类型(GenBank(AAH17865.1)所公布的、序列号19的形态)，已知缬氨酸的类型的抗体亲和性高、苯丙氨酸的类型的抗体亲和性低(非专利文献4和5)。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2017-118871号公报专利文献2:日本特开2015-086216号公报专利文献3:日本特开2016-169197号公报非专利文献非专利文献1:Takai.T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005非专利文献2:J.Galon等，Eur.J.Immunol.，27，1928-1932，1997非专利文献3:C.L.Chen等，ACSChem.Biol.，12，1335-1345，2017非专利文献4:H.R.Koene等，Blood，90，1109-1114，1997非专利文献5:P.Bruhns等，Blood，16，3716-3725，2009
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题包括：提供对碱的稳定性(耐碱性)提高的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、和使用该蛋白质的抗体吸附剂。另外，如上所述，FcγRIIIa识别抗体的糖链结构，因此将FcγRIIIa固定于不溶性载体而得到的吸附剂在制造抗体药物时的工序分析、分取中是有用的。但是，在欲使用上述吸附剂进行抗体药物的工业化制造时，以往的FcγRIIIa的利用基因重组体的生产率差，在成本方面存在课题。因此，根据情况，本专利技术的至少一个课题包括：提供与以往的FcγRIIIa相比利用基因重组体的生产率提高的FcγRIIIa氨基酸置换体。用于解决问题的方案本专利技术人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果确定了人FcγRIIIa中的与稳定性提高有关的氨基酸残基，并且发现将该氨基酸残基置换为其它的氨基酸残基而成的变异体对碱具有优异的稳定性。另外，本专利技术人们将序列号1所示的人FcγRIIIa的氨基酸序列中的第176位的氨基酸残基包罗性地置换为其它的氨基酸残基，结果发现了与以往的FcγRIIIa相比利用基因重组体的生产率提高的氨基酸置换体。基于这些见解，本专利技术人们完成了本专利技术。即，本专利技术包含以下的[1]至[11]中记载的方式。[1]一种Fc结合性蛋白质，其包含下述氨基酸残基且具有抗体结合活性，所述氨基酸残基为：在序列号4记载的氨基酸序列的第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基中至少具有以下所示的35处氨基酸置换的氨基酸残基；(1)序列号4的第37位的谷氨酸向甘氨酸的置换(2)序列号4的第39位的亮氨酸向甲硫氨酸的置换(3)序列号4的第43位的缬氨酸向谷氨酸的置换(4)序列号4的第45位的苯丙氨酸向异亮氨酸的置换(5)序列号4的第49位的谷氨酰胺向脯氨酸的置换(6)序列号4的第51位的酪氨酸向天冬酰胺的置换(7)序列号4的第56位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换(8)序列号4的第64位的谷氨酰胺向精氨酸的置换(9)序列号4的第67位的酪氨酸向组氨酸的置换(10)序列号4的第70位的谷氨酸向天冬氨酸的置换(11)序列号4的第72位的天冬酰胺向天冬氨酸的置换(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Fc结合性蛋白质，其包含下述氨基酸残基且具有抗体结合活性，所述氨基酸残基为：在序列号4记载的氨基酸序列的第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基中至少具有以下所示的35处氨基酸置换的氨基酸残基；/n(1)序列号4的第37位的谷氨酸向甘氨酸的置换/n(2)序列号4的第39位的亮氨酸向甲硫氨酸的置换/n(3)序列号4的第43位的缬氨酸向谷氨酸的置换/n(4)序列号4的第45位的苯丙氨酸向异亮氨酸的置换/n(5)序列号4的第49位的谷氨酰胺向脯氨酸的置换/n(6)序列号4的第51位的酪氨酸向天冬酰胺的置换/n(7)序列号4的第56位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换/n(8)序列号4的第64位的谷氨酰胺向精氨酸的置换/n(9)序列号4的第67位的酪氨酸向组氨酸的置换/n(10)序列号4的第70位的谷氨酸向天冬氨酸的置换/n(11)序列号4的第72位的天冬酰胺向天冬氨酸的置换/n(12)序列号4的第81位的丝氨酸向精氨酸的置换/n(13)序列号4的第84位的丝氨酸向脯氨酸的置换/n(14)序列号4的第90位的酪氨酸向苯丙氨酸的置换/n(15)序列号4的第91位的苯丙氨酸向异亮氨酸的置换/n(16)序列号4的第94位的丙氨酸向丝氨酸的置换/n(17)序列号4的第96位的苏氨酸向丝氨酸的置换/n(18)序列号4的第108位的天冬酰胺向丝氨酸的置换/n(19)序列号4的第133位的缬氨酸向谷氨酸的置换/n(20)序列号4的第135位的赖氨酸向缬氨酸的置换/n(21)序列号4的第137位的谷氨酸向甘氨酸的置换/n(22)序列号4的第138位的天冬氨酸向谷氨酸的置换/n(23)序列号4的第148位的赖氨酸向精氨酸的置换/n(24)序列号4的第156位的苏氨酸向甲硫氨酸的置换/n(25)序列号4的第157位的酪氨酸向苯丙氨酸的置换/n(26)序列号4的第163位的甘氨酸向缬氨酸的置换/n(27)序列号4的第174位的酪氨酸向缬氨酸的置换/n(28)序列号4的第181位的赖氨酸向谷氨酸的置换/n(29)序列号4的第187位的苯丙氨酸向丝氨酸的置换/n(30)序列号4的第194位的丝氨酸向精氨酸的置换/n(31)序列号4的第196位的天冬酰胺向赖氨酸的置换/n(32)序列号4的第200位的谷氨酸向甘氨酸的置换/n(33)序列号4的第201位的苏氨酸向丙氨酸的置换/n(34)序列号4的第203位的天冬酰胺向天冬氨酸的置换/n(35)序列号4的第206位的异亮氨酸向缬氨酸的置换。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171027 JP 2017-207810;20180111 JP 2018-002868;201.一种Fc结合性蛋白质，其包含下述氨基酸残基且具有抗体结合活性，所述氨基酸残基为：在序列号4记载的氨基酸序列的第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基中至少具有以下所示的35处氨基酸置换的氨基酸残基；
(1)序列号4的第37位的谷氨酸向甘氨酸的置换
(2)序列号4的第39位的亮氨酸向甲硫氨酸的置换
(3)序列号4的第43位的缬氨酸向谷氨酸的置换
(4)序列号4的第45位的苯丙氨酸向异亮氨酸的置换
(5)序列号4的第49位的谷氨酰胺向脯氨酸的置换
(6)序列号4的第51位的酪氨酸向天冬酰胺的置换
(7)序列号4的第56位的赖氨酸向谷氨酰胺的置换
(8)序列号4的第64位的谷氨酰胺向精氨酸的置换
(9)序列号4的第67位的酪氨酸向组氨酸的置换
(10)序列号4的第70位的谷氨酸向天冬氨酸的置换
(11)序列号4的第72位的天冬酰胺向天冬氨酸的置换
(12)序列号4的第81位的丝氨酸向精氨酸的置换
(13)序列号4的第84位的丝氨酸向脯氨酸的置换
(14)序列号4的第90位的酪氨酸向苯丙氨酸的置换
(15)序列号4的第91位的苯丙氨酸向异亮氨酸的置换
(16)序列号4的第94位的丙氨酸向丝氨酸的置换
(17)序列号4的第96位的苏氨酸向丝氨酸的置换
(18)序列号4的第108位的天冬酰胺向丝氨酸的置换
(19)序列号4的第133位的缬氨酸向谷氨酸的置换
(20)序列号4的第135位的赖氨酸向缬氨酸的置换
(21)序列号4的第137位的谷氨酸向甘氨酸的置换
(22)序列号4的第138位的天冬氨酸向谷氨酸的置换
(23)序列号4的第148位的赖氨酸向精氨酸的置换
(24)序列号4的第156位的苏氨酸向甲硫氨酸的置换
(25)序列号4的第157位的酪氨酸向苯丙氨酸的置换
(26)序列号4的第163位的甘氨酸向缬氨酸的置换
(27)序列号4的第174位的酪氨酸向缬氨酸的置换
(28)序列号4的第181位的赖氨酸向谷氨酸的置换
(29)序列号4的第187位的苯丙氨酸向丝氨酸的置换
(30)序列号4的第194位的丝氨酸向精氨酸的置换
(31)序列号4的第196位的天冬酰胺向赖氨酸的置换
(32)序列号4的第200位的谷氨酸向甘氨酸的置换
(33)序列号4的第201位的苏氨酸向丙氨酸的置换
(34)序列号4的第203位的天冬酰胺向天冬氨酸的置换
(35)序列号4的...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边辽子，远藤谕，寺尾阳介，大江正刚，
申请(专利权)人：东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP