组织因子靶向CAR-NK和CAR-T细胞疗法制造技术

公开了与识别组织因子(TF)的嵌合抗原受体(CAR)有关的方法和组合物。具体地，公开了包含fVII或其功能片段的CAR。还公开了包含本文公开的CAR的免疫效应细胞。

Tissue factor targeting car-nk and car-t cell therapy

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组织因子靶向CAR-NK和CAR-T细胞疗法相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月27日提交的美国临时申请号62/564,006的权益，该临时申请通过引用其全部内容并入本文。
技术介绍
组织因子("TF")是跨膜糖蛋白，是凝血级联的主要引发剂。在正常的生理条件下，活性TF不与血液接触。在血管损伤期间，暴露于内皮下TF和胶原的血液中会导致凝血因子和血小板的激活，随后导致止血栓子形成。在各种临床环境中不恰当地诱导TF表达可导致危及生命的血栓形成和/或导致病理学并发症。斑块破裂后的TF暴露被认为是导致急性心肌梗死和中风的血栓性闭塞的原因。在这些情况下，由凝血因子激活的促炎信号通路也导致水肿形成和梗死面积增加。与血管成形术相关的血管损伤导致平滑肌细胞(SMC)上的TF上调，这被认为会诱导与再狭窄相关的细胞信号通路。TF在癌症和革兰氏阴性脓毒症中的过度表达导致危及生命的血栓形成和炎性途径的激活。TF是病理性血管生成的调节剂。体内研究表明，TF在体内也是一种独特的病理性血管生成性血管内皮细胞(VEC)表面受体，因为它在来自患者或动物模型的肿瘤脉管系统(Contrino等人，1996；Folkman等人，1996；Hu等人，1999；Hu等人，2001；Cheng等人，2011；Duanmu等人，2011)、眼睛(Bora等人，2003)和异位(Krikun等人，2010)新血管系统中在体内血管生成VEC上具有选择性表达。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成依赖性癌症和非恶性人类疾病(Ferrara等人，2002)，例如黄斑变性(Klagsbrun等人，1987)，类风湿关节炎(Afuwape等人，2002)和子宫内膜异位(Fujimoto等人，1999)中起关键作用。具体地，在那些血管生成依赖性疾病中，VEGF通过与在病理性新血管系统(通常是微血管或毛细血管)中，VEC上的VEGR受体结合来刺激血管生成(Hu等人，Angiogenesis2016)。使用VEGF诱导的体外血管生成性血管内皮模型，结果表明TF是一种血管生成特异性受体，是因子VII靶向治疗的靶标(Hu等人，Angiogenesis2016)，表明TF靶向剂可能对治疗癌症(实体癌和白血病)、湿性与年龄有关的黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿关节炎具有治疗潜力。TF是癌细胞、癌症干细胞(CSC)(Hu等人，Oncotarget2016)和实体癌中的肿瘤血管内皮细胞的共同的(至今仍是特定的)生物标志物和治疗靶标。TF在这些癌细胞中高度表达(乳腺癌中80％-100％，肺癌中40％-80％，卵巢癌中84％)。这三种类型的癌症不仅难以控制，而且还是美国和世界范围内死亡的主要原因，并且经常形成基于CSC的对化学疗法和放射疗法的抗药性(Vidal等人，2014；Moncharmont等人，2012；Koch等人，2010)。除乳腺癌、肺癌和卵巢癌外，TF在许多其他人类实体癌、白血病、肉瘤、骨髓瘤和潜在淋巴瘤中也以高百分比表达(表1)，例如，原发性黑素瘤中95％，转移性黑素瘤中100％，胰腺癌中53％-90％，结直肠癌中57％-100％，肝细胞癌中63％-100％，原发性和转移性前列腺癌中60％-78％，神经胶质瘤中47％-75％(Hu.Antibodies2018)。最近，研究表明，TF在乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及潜在的其他实体癌(例如头颈癌)中由癌症干细胞表达，并且TF靶向剂可以根除那些TF表达的癌症干细胞而无耐药性(Hu等人，Oncotarget2016)。研究还表明，TF是由脉络膜新血管系统(CNV)表达的，它是AMD在实验动物中的模型(Bora等人，2003)。还已经表明，TF在子宫内膜异位病变中由血管生成性血管内皮细胞表达。嵌合抗原受体(CAR)表达的免疫效应细胞的过继转移代表新型的癌症免疫治疗方法。CAR的概念基于在T或NK细胞表面上表达新型受体的思想，其能使T和NK细胞识别靶细胞表面上的相应抗原。基本的CAR构建体由细胞外抗原识别结构域，通常是连接到细胞外间隔子结构域的单链抗体可变片段(scFv)、CD28的跨膜结构域和信号胞质结构域，例如4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、DAP10、ICOS和CD3ζ链(Cd3ζ)组成。最先进的应用是靶向CD19的CAR-T细胞的使用，CD19是B细胞恶性肿瘤的表面抗原，其已被证明对患者的B细胞恶性肿瘤具有抗肿瘤功效(P.J.Paszkiewiczetal.,Targetedantibody-mediateddepletionofmurineCD19CARTcellspermanentlyreversesBcellaplasia.JClinInvest126,4262-4272(2016))。本领域需要的是TF靶向CAR修饰的免疫效应细胞。附图说明并入在本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图阐明本公开的若干方面，并且与说明一起用以解释本公开的原理。图1A-B显示了TF靶向CAR1单体(图1A)和二聚体(图1B)的图。fVIIL：VII因子轻链。铰链：人IgG1的铰链区。GFP：绿色荧光蛋白。Puro：嘌呤霉素。CAR1单体和二聚体之间的唯一区别是，二聚体构建体包含IgG1铰链区，其中两个半胱氨酸残基将形成二硫键以形成同源二聚体。图2A-C显示了稳定的TF靶向CAR1-NK细胞系的产生。编码CAR1单体和二聚体的慢病毒已成功转染NK92MI/全长CD16(fCD16)细胞系，并且在选择2.5μg/ml嘌呤霉素的情况下已产生稳定的细胞系(图2a和b)。未感染的NK92MI/fCD16细胞用作对照，不表达GFP(图2c)。使用明亮和绿色通道拍摄照片，并在Zeo细胞成像仪(Bio-Rad)下合并。比例尺：100μm。图3A-F显示了质粒pCDH和编码TF靶向CAR1二聚体和单体的慢病毒可以使用PEG-it纯化病毒(图3c、3d)或上清液中未纯化的载体(SNT)(图3e、3f)转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(图3a、3b)和感染人胚胎肾细胞293AD。使用明亮和绿色通道拍摄照片，并在Zeo细胞成像仪(Bio-Rad)下合并。比例尺：100μm。图4A-D显示了通过RT-PCR，CAR1、CD16和β肌动蛋白在NK92MI/fCD16细胞中的表达。通过Trizol试剂从用CAR1单体(M)或二聚体(D)稳定转染的NK92MI/fCD16细胞中提取总RNA。未用CD16质粒转染的亲本NK92MI细胞用作CAR1和CD16的阴性对照(C)。A.CAR1。B.CD16。C.检验了β肌动蛋白作为总RNA的上样对照。来自两个独立实验的代表性照片。D.使用抗人因子VIIHRPO偶联物(CedarlaneLaboratories)进行fVII表达的ELISA检测。D中的数据表示为平均值+/-SEM。图5A-D显示了在原位NSG小鼠模型中TF-CAR-NK细胞对TNBC细胞的体外细胞毒性、功效和安全性，以及在体内用于TNBCCDX的治疗。A.使用CytoTox均相测定法(Pro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含嵌合抗原受体(CAR)的组合物，其中所述CAR包含组织因子(TF)结合结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170927 US 62/564,0061.包含嵌合抗原受体(CAR)的组合物，其中所述CAR包含组织因子(TF)结合结构域。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TF结合结构域包含因子VII(fVII)或其片段，其中所述片段具有足以识别TF的长度。


3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述TF结合结构域包含可变片段，例如重链(VH)、轻链(VL)或单链可变片段(scFv)。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包含跨膜结构域。


5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含CD28。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包含一个或多个胞质结构域。


7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胞质结构域包含4-1BB。


8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中胞质结构域包含CD3ζ。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包括铰链区。


10.根据权利要求6所述的组合物，其中所述铰链区衍生自人IgG1。


11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物靶向组织因子(TF)。


12.根据权利要求1所述的组合物，其中因子VII包括轻链因子VII。


13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述轻链fVII包含SEQIDNO:4。

...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志伟，
申请(专利权)人：俄亥俄州创新基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US