本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆miR‑363‑3p在抑制细菌感染中的应用。本发明专利技术的miR‑363‑3p能够抑制泛素特异性蛋白酶ubiquitin‑specific protease 32(USP32)的表达。本发明专利技术的miR‑363‑3p注射牙鲆后能够显著抑制海豚链球菌(Streptococcus iniae)的复制。
【技术实现步骤摘要】
牙鲆miR-363-3p的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆miR-363-3p在抑制细菌感染中的应用。
技术介绍
miRNA(microRNA)是长度为21～25核苷酸的非编码小RNA，具有调控基因表达的作用。miRNA广泛存在于动物、植物以及微生物。在动物中，miRNA基因首先转录成primarymiRNA，随后加工成precursormiRNA，最后成为成熟的miRNA。通常miRNA特异性地结合到靶基因的3’-untranslatedregion(UTR)，从而降解靶基因的mRNA或通过转录后方式抑制靶基因编码蛋白质的合成。miRNA参与各种生理及病理活动，包括代谢、细胞增值、分化、凋亡、免疫以及癌症等。已有研究表明，miRNA在许多微生物病原的感染过程中起重要作用，是抗感染免疫的重要研究靶点。在鱼类中，大量免疫相关miRNA已被发现，但是它们的具体调控功能绝大多数未知。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种牙鲆miR-363-3p在抗细菌中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种牙鲆miR-363-3p序列的应用，牙鲆miR-363-3p序列在制备抑制泛素特异性蛋白酶ubiquitin-specificprotease32(USP32)的表达制剂中的应用。一种牙鲆miR-363-3p序列的应用，牙鲆miR-363-3p序列在制备抑制细菌感染的制剂中的应用。所述细菌为海豚链球菌(Streptococcusiniae)。所述牙鲆miR-363-3p序列为SEQIDNO:1所示的碱基序列。所述序列为SEQIDNO:1所示同源性90％以上的碱基序列。本专利技术具有如下优点：本专利技术的miR-363-3p注射牙鲆后能够显著抑制USP32基因的表达和抑制海豚链球菌的感染。该专利技术是首次发现鱼类小RNA通过调控USP32基因的表达而抑制细菌感染。附图说明图1为本专利技术实施例提供的miR-363-3p抑制海豚链球菌感染脾脏的结果图(*P<0.05)。图2为本专利技术实施例提供的miR-363-3p抑制海豚链球菌感染肾脏的结果图(*P<0.05)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。实施例1miR-363-3p抑制免疫相关基因USP32的表达步骤1)miR-363-3p稀释液和NC稀释液制备本专利技术的miR-363-3p的序列为:5’-AAUUGCACAGUAUCCAUCUGC-3’；其是由上海Genepharma公司合成。miR-363-3p的对照分子(命名为NC)序列为:5’-GACCACCGCUAUCCGUAUCUAU-3。将miR-363-3p和NC分别经DEPC水(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)稀释至200μg/μl，即分别为miR-363-3p稀释液和NC稀释液。SEQIDNO:1AAUUGCACAGUAUCCAUCUGC(a)序列特征：●长度：21●类型：核苷酸序列●链型：单链●拓扑结构：线性(b)分子类型：RNA(c)假设：否(d)反义：否(e)最初来源：牙鲆步骤2)注射鱼类将15条牙鲆(每条重约10g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为A、B和C。将A组的每条鱼分别肌肉注射100μl步骤1)的miR-363-3p稀释液，将B组的每条鱼分别肌肉注射100ul步骤1)的NC稀释液，将C组的每条鱼分别肌肉注射100ulDEPC水(对照组)。步骤3)基因表达检测对上述步骤2)的各组注射后第10h，取鱼脾脏和肾脏组织。利用EZNATotalRNA试剂盒(购于OmegaBio-tek,Doraville,美国)提取总RNA，用于cDNA制备和荧光定量PCR(qRT-PCR)检测USP32基因的表达。具体参见文献ZhengWJ,SunL.EvaluationofhousekeepinggenesasreferencesforquantitativerealtimeRT-PCRanalysisofgeneexpressioninJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus).FishShellfishImmunol.2011；30:638–45。结果表明，与对照组(C组)相比，A组鱼脾脏和肾脏的USP32基因表达水平分别降低2倍和2.3倍，显著(P<0.05)低于对照组，而B组鱼的USP32表达水平与对照组无显著差别。这些结果表明，miR-363-3p能显著抑制免疫相关基因USP32的表达。实施例2miR-363-3p抗海豚链球菌作用步骤1)miR-363-3p稀释液和NC稀释液的制备：同上述实施例1步骤1。步骤2)miR-363-3p-细菌注射液和NC-细菌注射液的制备在LB培养基中培养海豚链球菌至OD600为0.8,然后离心(5000g，40C，10min)，收集菌体，将其悬浮于上述步骤1)制备的miR-363-3p稀释液和NC稀释液中至终浓度为107cfu/ml，分别命名为miR-363-3p-细菌注射液和NC-细菌注射液。所述海豚链球菌保存于中国科学院微生物研究所CGMCC，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080，保藏编号为：CGMCCNo.1984，保藏日期2007.3.22，分类命名为海豚链球菌(Streptococcusiniae)。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。步骤3)注射鱼类将15条牙鲆(每条重约10g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为A、B和C。将A组的每条鱼分别肌肉注射100μl上述步骤1)的miR-363-3p-细菌注射液，将B组的每条鱼分别肌肉注射100ul上述步骤1)的NC-细菌注射液，将C组的每条鱼分别肌肉注射100ulDEPC水(对照组)。步骤4)细菌感染检测对上述步骤3的各组注射后第10h，取鱼脾脏和肾脏组织，在1mlPBS中匀浆，将匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，A组鱼脾脏的细菌数显著(P<0.05)低于B组和C组鱼(图1)；同样，A组鱼肾脏的细菌数显著(P<0.05)低于B组和C组鱼(图2)。这些结果表明，miR-363-3p能够显著抑制海豚链球菌的侵染。序列表<110>中国科学院海洋研究所<120>牙鲆miR-363-3p的应用<160>1<170>SIPOSequenceListing1.0<210>本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牙鲆miR-363-3p序列的应用，其特征在于：牙鲆miR-363-3p序列在制备抑制泛素特异性蛋白酶ubiquitin-specific protease 32(USP32)的表达制剂中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.一种牙鲆miR-363-3p序列的应用，其特征在于：牙鲆miR-363-3p序列在制备抑制泛素特异性蛋白酶ubiquitin-specificprotease32(USP32)的表达制剂中的应用。
2.一种牙鲆miR-363-3p序列的应用，其特征在于：牙鲆miR-363-3p序列在制备抑制细菌感染的制剂中的应用。
3.按权利要求2所述的序列的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，孙验玲，管晓璐，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。