【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】驱动所需基因表达的质粒成瘾系统相关申请的交叉引用本申请要求于2018年7月13日提交的标题为“驱动所需基因表达的质粒成瘾系统”的美国临时专利申请号62/697531以及于2017年7月21日提交的标题为“驱动所需基因表达的质粒成瘾系统”的美国临时专利申请号62/535596的优先权，两者的公开内容在此通过引用整体并入。
本专利技术的领域涉及用于使用琥珀酸途径的基因在微生物生产菌株中维持目标染色体外元件以确保子细胞中元件的包含和表达的方法和工艺。更具体地，本专利技术涉及质粒成瘾系统的用途，该系统确保修饰的微生物细胞将维持携带涉及产生所需表达产物的基因的质粒。
技术介绍
本专利技术涉及一种操纵培养中的微生物细胞以维持至少一种含有至少一种目标基因的目标染色体外元件的方法。通常，该染色体外元件是质粒，尽管噬菌体、原噬菌体、噬菌粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)也含有染色体外元件以含有异源目标转基因。尽管天然存在于细菌中，但并非所有野生型质粒都含有在正常条件下维持宿主细胞活力所需的遗传信息。然而，质粒可以含有遗...
【技术保护点】
1.一种转化的细菌宿主细胞，其含有：/ni)编码至少一种目标蛋白的染色体外DNA序列，所述序列的表达被至少一种染色体外元件调控并与其可操作地连接；和，/nii)已从所述细菌宿主细胞中除去的编码至少一种必需的琥珀酸途径基因的DNA序列；/niii)其中，这些序列与质粒中所含的目标DNA序列互补；并且，/niv)其中，两个DNA序列都位于DNA序列的核糖体结合位点的上游或下游。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
【国外来华专利技术】20170721 US 62/535,596;20180713 US 62/697,5311.一种转化的细菌宿主细胞，其含有：
i)编码至少一种目标蛋白的染色体外DNA序列，所述序列的表达被至少一种染色体外元件调控并与其可操作地连接；和，
ii)已从所述细菌宿主细胞中除去的编码至少一种必需的琥珀酸途径基因的DNA序列；
iii)其中，这些序列与质粒中所含的目标DNA序列互补；并且，
iv)其中，两个DNA序列都位于DNA序列的核糖体结合位点的上游或下游。
2.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述DNA序列对于所述细胞是外源的。
3.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述染色体外DNA序列编码超过一种目标多肽。
4.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述染色体外DNA序列编码超过一种必需的琥珀酸途径基因，其中每种基因对于所述细胞的中心代谢都是必需的。
5.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述外源DNA序列在启动子的控制下。
6.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述染色体外元件是质粒。
7.一种根据权利要求6所述的质粒，其中，复制起点源自pBR322、pMB1、ColE1、pSC101或p15A。
8.一种在包含根据权利要求1所述的细菌细胞的转化的微生物宿主细胞中维持两种或更多种质粒的方法，其中，所利用的每种质粒含有所需的琥珀酸途径基因中的至少一种，并且所述质粒中的至少一种共同含有能够表达蛋白产物的目标基因，其中，所述转化的细菌细胞在足以允许所述细胞生长的条件下存在。
9.一种用于在转化的细菌宿主中产生目标重组蛋白的方法，其包括：
a)将至少一种重组质粒引入到所述细菌宿主细胞中，其中，所述重组质粒包含克隆的DNA序列，所述DNA序列包含编码必需的琥珀酸途径基因的全部或部分基因，所述基因对于宿主细胞的生存是必需的，并且还编码至少一种编码蛋白产物的目标基因；
b)选择含有重组质粒的转化宿主的存活菌落；和，
c)使用所述存活菌落来发酵细菌菌落以允许表达所述蛋白产物。
10.根据权利要求9所述的蛋白产物，其中，所述重组蛋白产物另外包含将优化纯化、分离或标记的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的细菌细胞，其中，所述必需基因与含有目标DNA序列的启动子可操作地连接。
12.根据权利要求11所述的细菌细胞，其中，与所述必需基因连接的所述启动子是诱导型的。
13.根据权利要求12所述的细菌细胞，其中，所述诱导型启动子独立于控制外源DNA序列的任何其它诱导型启动子。
14.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述DNA序列ii)插入在核糖体结合位点和所述DNA序列i)的起始密码子之间。
15.根据权利要求1所述的细菌细胞，其中，所述DNA序列i)和所述DNA序列ii)是转录偶联的。
16.根据权利要求15所述的细菌细胞，其中，所述细胞选自包含以下的组：大肠杆菌细胞；棒杆菌属、弧菌属；埃希氏菌属；肠杆菌属；柠檬酸杆菌属；欧文氏菌属；芽孢杆菌属；假单胞菌属；蓝藻属；沙门氏菌属和克雷伯菌属。
17.根据权利要求16所述的宿主-载体系统，其中，所述质粒另外含有编码蛋白产物的第二目标基因。
技术研发人员：MDLP马托兹，D金，S卡拉克森，
申请(专利权)人：科纳根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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