一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备方法技术

本发明专利技术将拉曼的特点与精确检测的探针首次通过特定的方法结合起来，制备出了靶向检测胶原蛋白的拉曼探针Cys‑Ahx‑(Gly‑Pro‑Hyp)

A peptide Raman probe for collagen recognition and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备方法
本专利技术涉及一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备和成像方法，属于生物检测

技术介绍
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％-30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白是人体关键的结构和功能蛋白，是皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织的主要成分，在细胞迁移、增殖、分化等基本的生命活动中发挥重要作用，胶原蛋白的过度降解与肿瘤、关节炎等严重疾病息息相关。而肿瘤作为一种全球性疾病，发展周期长、致死率极高，因此，肿瘤的早期检测对于肿瘤的治疗而言极为重要。目前肿瘤诊断依赖于病理学检测，大多数肿瘤能获得明确诊断，但尚有10％患者不能确诊。现在发展的组织成像技术大大促进了肿瘤病理诊断水平的提高，包括免疫荧光、免疫组化、免疫电子显微镜等。胶原蛋白是细胞外基质的主要结构蛋白，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥直接作用，是肿瘤早期检测的重要生物标志物。因此，建立胶原蛋白的高效检测方法，对于肿瘤等疾病的基础机理研究和诊断技术开发都非常关键。拉曼光谱是一种散射光谱，它通过对与入射光频率不同的散射光谱进行分析获得分子的振动、转动信息，用于分子结构的深度解析。与常用的荧光方法相比，拉曼散射显示出以下优点：①拉曼散射对光漂白有抵抗力，这使得拉曼信号非常稳定并且可以用于长时间的样品分析；②拉曼信号的峰宽狭窄，允许它轻松地进行多重检测；③拉曼信号可提供丰富的分子信息，可以揭示生物分子的指纹行为。因此，拉曼成像，作为一种新兴的检测方法，在化学、生物学和医学分析中的应用引起越来越多的关注。开发一种靶向识别胶原蛋白的拉曼成像方法，将为解析胶原相关疾病的机理提供新的工具，为这些疾病的诊断和治疗提供新的机会。但是，将拉曼成像与靶向识别胶原蛋白的多肽序列结合，制备多肽拉曼探针往往存在以下问题：①靶向识别胶原蛋白的多肽序列的选择以及纳米粒子的选择和配比在组织成像方面至关重要，既要考虑到靶向识别胶原蛋白的多肽序列对病变胶原蛋白的特异性结合能力，又要兼顾拉曼信号成像技术，因此，目前制备的拉曼探针容易出现非特异性吸附、定位不准的问题；②纳米粒子的种类和规格的选择也至关重要，纳米粒子太小一般不具备拉曼增强能力，而纳米粒子太大在组织成像中容易由于重力沉积有过多的非特异性吸附，扰乱成像结果准确性；③拉曼探针的制备方法对于拉曼成像效果也十分关键，如果直接将信号分子连接到多肽上，操作简单，但是获得的拉曼探针中纳米粒子对信号分子的增强效果很微弱，不容易得到信号峰，导致成像效果较差。因此，获得一种既具有特异性结合病变胶原蛋白能力且靶向定位准确，又能够高效准确成像的靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，可以为体外组织和体内活体拉曼成像提供了新的工具，也为肿瘤等胶原蛋白相关疾病的深入研究提供了一种有竞争力的检测方法。本专利技术将拉曼的特点与精确检测的探针首次通过特定的方法结合起来，制备出了检测胶原蛋白的拉曼探针Cys-Ahx-(Gly-Pro-Hyp)7-Ag纳米粒子-4-MBN和拉曼探针Cys-Ahx-LRELHLNNNG-Ag纳米粒子-R1，所述R1和4-MBN为信号分子，其中R1为硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯。制备的多肽拉曼探针能够准确靶向定位胶原蛋白并特异性的结合胶原蛋白，又能够高效准确的成像。本专利技术还提供了特定合成多肽拉曼探针的方法：通过固相合成胶原蛋白靶向多肽，再将信号分子和胶原蛋白靶向多肽修饰到Ag纳米粒子上。本专利技术提供的多肽拉曼探针，具有显著增强的拉曼信号，并且对胶原蛋白具有高特异性的结合能力，制备简单、检测方便，可用于体外和体内组织成像，为胶原蛋白相关疾病的研究提供了一种有潜力的检测工具。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备和成像方法。本方法利用可以特异性结合胶原蛋白的多肽序列，结合增强拉曼信号的纳米粒子和拉曼信号分子开发的新型多肽探针，制备简单、检测方便、无生物毒性。该探针通过特定的设计和配比条件筛选，解决了纳米探针在组织成像方面非特异性吸附、定位不准的问题，为体外组织和体内活体拉曼成像提供了新的工具，为肿瘤等胶原蛋白相关疾病的深入研究提供了一种有竞争力的检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列、具有拉曼增强能力的纳米粒子和拉曼信号分子，所述多肽序列的N端通过一个小片段连接半胱氨酸，所述半胱氨酸和拉曼信号分子同时修饰在纳米粒子的表面。优选地，所述多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Y-Z，其中，Cys为半胱氨酸，X为包含4-46个氨基酸的胶原蛋白靶向多肽序列，Linker为连接半胱氨酸和胶原蛋白靶向多肽的小片段；Y为具有拉曼增强能力的纳米粒子，Z为拉曼信号分子，X和Z均修饰在Y表面。优选地，所述Linker包括6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种。优选地，所述Linker为6-氨基己酸。优选地，所述纳米粒子Y为过渡金属纳米粒子、半导体纳米基底及纳米粒子负载到三维结构物质上形成的SERS复合基底中的至少一种。优选地，所述纳米粒子Y为银纳米粒子。优选地，所述信号分子Z为4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种。优选地，所述信号分子包括4-MBN、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯。优选地，所述X包括(Gly-Pro-Hyp)7、LRELHLNNNG。优选地，所述靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的序列为Cys-Ahx-(Gly-Pro-Hyp)7-Ag纳米粒子-4-MBN。优选地，所述靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的序列为Cys-Ahx-LRELHLNNNG-Ag纳米粒子-R1，其中R1为硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯。一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，所述方法包括：(1)固相合成靶向结合胶原蛋白的多肽序列；(2)将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；(3)将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上。优选地，所述步骤(1)中固相合成靶向结合胶原蛋白的多肽序列的方法为：a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；c)将N端由Fmoc保护的氨基酸与HOBt和HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于，其包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列；探针的N端为半胱氨酸，帮助探针结合到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过一个小片段连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；具有拉曼增强能力的纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子，提供拉曼检测信号。/n

【技术特征摘要】
20190311 CN 20191017865651.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于，其包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列；探针的N端为半胱氨酸，帮助探针结合到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过一个小片段连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；具有拉曼增强能力的纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子，提供拉曼检测信号。


2.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，为以下步骤：1)固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽；2)将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；3)将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上。


3.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，其特征在于，体外组织成像方法为，使用多肽拉曼探针溶液对组织切片进行染色，在2-6℃孵育1-4hrs，吸去染色液后，1×PBS洗掉未结合的拉曼探针，使用拉曼显微镜进行成像；体内活体成像方法为，将多肽拉曼探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。


4.根据权利要求1所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于：多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Y-Z，其中，Cys为半胱氨酸，X为包含4-46个氨基酸的胶原蛋白靶向多肽，Linker为连接半胱氨酸和胶原蛋白靶向多肽的小片段；Y为具有拉曼增强能力的纳米粒子，Z为拉曼信号分子，X和Z均修饰在Y表面；连接半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列的小片段为6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种；具有拉曼增强能力的纳米粒子为过渡金属纳米粒子和半导体纳米基底及纳米粒子负载到三维结构物质上形成的SERS复合基底中的至少一种；信号分子为4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种。


5.根据权利要求2所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽的方法为：
a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸与HOBt和HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs，氨基酸、HOBt、HBTU与DIEA的摩尔比为4:4：4:6；
d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，粘琳格，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62