寡糖的发酵生产制造技术

本申请公开了通过利用乳糖培养具有编码单个岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，以高产量制备2'‑FL和DFL的混合物的方法。可以将得到的2'‑FL和DFL的混合物进行用酸起始的或由岩藻糖苷酶介导的水解，从而以高产量产生岩藻糖。

Fermentation of oligosaccharides

【技术实现步骤摘要】
寡糖的发酵生产本申请是2016年3月4日提交到中华人民共和国国家知识产权局的专利技术名称为“寡糖的发酵生产”、申请号为“201480048938.9”的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及通过发酵制备2'-FL(2'-O-岩藻糖基乳糖，Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)和DFL(二岩藻糖基-乳糖，Fuc(α1-2)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Glc)的混合物的方法和所述混合物用于制备岩藻糖(6-脱氧-半乳糖)的用途。专利技术背景岩藻糖是所谓的稀有单糖中的一种。其在来自很多不同来源的多种天然产物中被发现为D-和L-型两种。哺乳动物细胞可以制备岩藻糖基化的多糖，如ABO血型抗原和多种人乳寡糖。在海胆卵和青蛙卵中存在岩藻糖。岩藻糖存在于来自植物如海藻(褐藻糖胶(fucoidan)，硫酸盐化的岩藻糖聚合物的形式)，黄蓍胶，马铃薯，猕猴桃，大豆，翅豆品种，加拿大油菜等的多糖中。在植物中，岩藻糖通常与植物多糖相关，所述植物多糖常常是高度分支的结构，在多糖链的末端或多糖链内具有L-吡喃岩藻糖基单位。人或动物糖蛋白的N-和O-糖基二者都可以含有结合于碳水化合物链的末端的岩藻糖。此外，来自细菌、真菌和微藻的细胞外多糖也含有岩藻糖。在所有天然活细胞中的岩藻糖基化过程具有两个常见特征：其由岩藻糖基转移酶介导，所述岩藻糖基转移酶将岩藻糖基残基携带到适当的接受者上，并且其形成活化的岩藻糖核苷酸，即，GDP-岩藻糖，不是游离形式的岩藻糖。最近对游离形式的岩藻糖，特别是L-岩藻糖的兴趣增加，因为其可能用于治疗各种疾病，炎性病况和与人免疫系统相关的病症。岩藻糖也已经用于化妆品，用于皮肤保湿、皮肤再生、作为抗衰老剂以及用于预防皮肤炎症。岩藻糖已经从天然来源获得，从单糖化学或酶学合成和通过微生物辅助的过程产生。从天然来源，已经从生物量，如藻，通过提取分离含有岩藻糖的寡糖，并且随后已经将寡糖水解以提供岩藻糖和相关糖和衍生物的复合体混合物。岩藻糖的回收通常需要复复杂的分离技术如利用阴离子或阳离子交换树脂的色谱，透析，级分结晶等，着取决于附随的糖或糖相关化合物的性质(例如WO2005/040430，P.Saari等人J.LiquidChrom.Rel.Technol.32，2050(2009))。岩藻糖的化学合成涉及常见单糖如L-半乳糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露糖和L-鼠李糖的化学修饰(参见综述：P.T.Vanhooren等人J.Chem.Technol.Biotechnol.74，479(1999)，WO2011/144213，WO2013/046180，WO2013/046181)。岩藻糖和其类似物的酶合成使用多酶体系从墨角藻糖(fuculose)-6-磷酸盐进行(参见WO97/15683)。也已经培养了来自产碱菌属物种(Alcaligenessp.)的细菌来产生富含岩藻糖的细胞外多糖，岩藻糖通过酸性水解被从其中释放(参见EP-A-102535)。类似地，已经发现来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌株在有氧发酵条件下能够产生含有L-岩藻糖的多糖，已经通过酸性水解和很多纯化步骤从其中分开和分离岩藻糖(参见WO2012/034996)。近期已经通过冗长的化学方法步骤顺序合成了岩藻糖基化的乳糖，特别是2'-FL和DFL(参见WO2010/070616，WO2010/115934，WO2010/115935，Takeo等人Carbohydr.Res.141，159(1985)，Fernandez-Mayoralas等人Carbohydr.Res.154，93(1986))。然而，已经寻求产生岩藻糖基化的乳糖的较低成本方式，如通过利用转化的大肠杆菌发酵(参见Drouillard等人Angew.Chem.Int.Ed.45，1778(2006)；M.Randriantsoa：Synthèsemicrobiologiquedesantigènesglucidiquesdesgroupessanguins，ThèsedeDoctoratsoutenuele30/09/2008al’UniversitéJosephFourier，Grenoble，France；WO2010/070104；WO2010/142305；WO2012/097950WO2012/112777；Lee等人Microb.CellFact.11:48(2012)；等人Microb.CellFact.12:40(2013))。然而，已经继续寻找低成本制造岩藻糖基化的乳糖的更好方法，所述岩藻糖基化的乳糖可以被水解，从而以低成本产生岩藻糖。专利技术概述本专利技术的第一个方面涉及以高产量获得2'-FL和DFL的混合物(任选地含有FLU(2'-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)和/或FFL((Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc))的方法，其包括在含有乳糖的水性培养或发酵培养基中培养或发酵，具有编码单个岩藻糖基转移酶，有利地是1,2-岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，有利地是大肠杆菌，更有利地是LacZ-Y+大肠杆菌细胞的步骤，所述岩藻糖基转移酶能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2'-FL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2'-FL是必需的；该方法特征在于：-在培养基中提供乳糖达多于4天，有利地多至7天；和/或有利地以连续的方式，在培养基中提供，至少50，有利地是至少75，更有利地是至少100，甚至更有利地是至少125克的乳糖/1升的初始培养体积，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍，有利地是不大于其两倍，更有利地是小于其两倍。有利地，得到的培养基中的2'-FL和DFL的混合物为每升的培养基中至少75，更有利地是至少100，特别是至少115克。更有利地，得到的混合物中的DFL的重量包括有利地是至少2.5％，更有利地是至少5％，甚至更有利地是至少10％，特别是至少20％的2'-FL的重量。此外有利地是，在培养步骤之前在培养基中提供碳基底物，更有利地是葡萄糖，以产生遗传修饰的细胞的指数细胞生长。此外有利地是，将碳源和能源，更有利地是甘油，与乳糖一起加入培养基中。此外有利地是，在培养步骤期间，遗传修饰的细胞将2'-FL和DFL的混合物分泌到培养基的细胞外空间中。本专利技术的第二方面涉及以高产量获得岩藻糖，特别是L-岩藻糖的方法，其包括将下述物质进行由酸起始的或由岩藻糖苷酶介导的水解的步骤：-2'-FL和/或DFL，优选至少DFL，从包含2'-FL和DFL的混合物中分离，所述混合物通过本专利技术的第一方面的方法获得，并且其中DFL的重量包括有利地至少2.5％，更有利地至少5％，甚至更有利地至少10％，特别是至少20％的2'-FL的重量。有利地，水解利用强酸，更有利地是利用硫酸进行。本专利技术的第三个方面涉及以高产量从乳糖获得2'-FL的方法，其包括以下步骤：在含有乳糖的水性培养基中培养具有编码岩藻糖基转移酶，有利地是1,2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种混合物，其包含2’-FL和/n-DFL+FLU或/n-DFL+FFL或/n-DFL+FLU+FFL。/n

【技术特征摘要】
20130906 DK PA2013704981.一种混合物，其包含2’-FL和
-DFL+FLU或
-DFL+FFL或
-DFL+FLU+FFL。


2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述混合物通过包括以下步骤的方法获得：在含有乳糖的水性培养基中，培养具有单个重组糖基转移酶的遗传修饰的LacZ-Y+大肠杆菌细胞，所述糖基转移酶是1,2-岩藻糖基转移酶，其能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2'-FL或DFL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2'-FL或DFL是必需的；所述方法特征在于：
-以连续的方式，向培养基中加入至少75克的乳糖/1升的初始培养体积，多于4天，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基的体积的三倍。

【专利技术属性】
技术研发人员：久洛·戴卡尼，波利娜·佩尔蒂埃潘，多劳·莫尔纳加博尔，马库斯·赫德罗斯，
申请(专利权)人：格礼卡姆股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK