寡糖的制造制造技术

本发明专利技术涉及一种用于制造寡糖、优选3～8个单糖单元的寡糖、更优选3～5个单糖单元的寡糖、特别是HMO的基因修饰微生物，其包括一个或多个编码蔗糖利用系统的基因，因此该微生物可以使用蔗糖作为碳源和能量来源。以使用蔗糖作为碳源和能量来源。以使用蔗糖作为碳源和能量来源。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡糖的制造


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及使用基因修饰微生物特别是大肠杆菌(E.coli)，使用蔗糖作为其专用碳源的寡糖、特别是人乳寡糖(HMO)的微生物制备。

技术介绍

[0002]近来，使用重组微生物的异种(foreign)或外源寡糖的发酵合成在商业和工业上已经变得备受关注。在这种合成中，目的寡糖将通过由微生物的一种或多种异源糖基转移酶介导的糖受体的酶促糖基化来合成，并且糖基化所需的一种或多种活化的糖核苷酸将由相同的微生物通过过表达一个或多个编码内源活化的糖核苷酸产生酶的基因而产生。这种合成的代谢途径需要碳源，其主要为简单的碳结构单元，通常为甘油或葡萄糖(参见，例如，WO 01/04341、Priem等人,Glycobiology 12,235(2002)、Fort等人,Chem.Comm.2558(2005)、Drouillard等人,Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)、WO 2010/070104、WO 2012/112777、WO 2013/182206、WO 2014/048439)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制造寡糖或所述寡糖的糖苷的基因修饰微生物，包括：a.编码糖基转移酶的重组基因，所述糖基转移酶能够将活化的糖核苷酸的糖残基i.转移至碳水化合物受体或所述受体的糖苷，其中所述受体被微生物内化，和/或ii.转移至从所述受体到所述寡糖的生物合成途径中的中间体，b.用于从蔗糖制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途径，和c.一个或多个编码异源PTS
‑
依赖性蔗糖利用系统的基因，使得所述细胞能够使用蔗糖作为用于制造所述活化的糖核苷酸的碳源，并作为制造所述寡糖的能量来源，其中所述碳水化合物受体不是蔗糖，或所述受体的糖苷，并且所述异源PTS
‑
依赖性蔗糖利用系统包括由scr基因编码的蛋白质，scrY用于蔗糖孔蛋白，scrA用于PTS透性酶，scrB用于蔗糖
‑6‑
磷酸水解酶，scrR用于阻遏蛋白，并且其中编码糖基转移酶的重组基因插入微生物的基因组中，和/或scr基因插入微生物的基因组中。2.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其是不含质粒的。3.根据权利要求1或2所述的基因修饰微生物，其中所述scr基因可操作地连接到glp启动子，例如glpF启动子，如SEQ ID NO:5的glpF启动子。4.根据权利要求1至3所述的基因修饰微生物，其中寡糖或碳水化合物受体的糖苷中的苷元选自：
‑‑
OR
A
，其中R
A
为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R
A
表示芳基部分，或者R
A
表示能通过氢解作用除去的基团，
‑‑
X
‑
R
B
，其中X为N或S，且R
B
表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R
B
表示芳基部分，或者R
B
表示苯甲基，
‑
将异头碳原子与相邻碳原子通过
‑
NH
‑
C(＝O)
‑
O
‑
桥彼此连接的基团，从而形成以醛糖的情况示出的稠合五元环：
‑
叠氮化物，
‑‑
NH
‑
C(R”)＝C(R
’
)2，其中每个R
’
独立地为选自
‑
CN、
‑
COOH、
‑
COO
‑
烷基、
‑
CO
‑
烷基、
‑
CONH2、
‑
CONH
‑
烷基和
‑
CON(烷基)2的吸电子基团，或者其中两个R
’
基团连接在一起形成
‑
CO
‑
(CH2)2‑4‑
CO
‑
，并由此与其连接的碳原子形成5～7元的环烷基
‑
1,3
‑
二酮，在所述二酮中任意的亚甲基任选被1或2个烷基取代，并且其中R”为H或烷基，
‑
氨基酸残基，
‑
聚乙二醇残基，
‑
聚乙烯醇残基，和
‑
式A的α,β
‑
不饱和酰胺基基团或者式B的α,β
‑
不饱和羰基基团
其中Q2、Q3和Q4独立地为H和C1‑
C6烷基，其中烷基任选被卤素、OH、硝基或苯基取代。5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因修饰微生物，其为大肠杆菌(E.coli.)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因修饰微生物，其中一个或多个以下基因是缺失的或失活的：lacZ、lacI、lacA和hlyE。7.根据权利要求6所述的基因修饰微生物，其中lacZ是缺失的或失活的，并且任选地一个或多个以下基因是缺失的或失活的：lacI、lacA和hlyE。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的基因修饰微生物，用于制造式1的寡糖：其中：Y是
‑‑
OH
‑‑
OR
A
，其中R
A
为直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R
A
表示芳基部分，或者R
A
表示可通过氢解作用除去的基团，
‑‑
X
‑
R
B
，其中X为N或S，并且R
B
表示直链或支链烃链，当饱和时，其具有1～24个、优选1～6个碳原子，或者当不饱和时，其具有2～24个、优选2～6个碳原子，或者R
B
表示芳基部分，或者R
B
表示苯甲基，
‑
将异头碳原子与相邻碳原子通过
‑
NH
‑
C(＝O)
‑
O
‑
桥彼此连接的基团，从而形成以醛糖的情况示出的稠合五元环：
‑
叠氮化物，
‑‑
NH
‑
C(R”)＝C(R
’
)2，其中每个R
’
独立地为选自
‑
CN、
‑
COOH、
‑
COO
‑
烷基、
‑
CO
‑
烷基、
‑
CONH2、
‑
CONH
‑
烷基和
‑
CON(烷基)2的吸电子基团，或者其中两个R
’
基团连接在一起形成
‑
CO
‑
(CH2)2‑4‑
CO
‑
，并由此与其连接的碳原子形成5～7元的环烷基
‑
1,3
‑
二酮，在所述二酮中任意的亚甲基任选被1或2个烷基取代，并且其中R”为H或烷基，
‑
氨基酸残基，
‑
聚乙二醇残基，
‑
聚乙烯醇残基，或
‑
式A的α,β
‑
不饱和酰胺基基团或者式B的α,β
‑
不饱和羰基基团其中Q2、Q3和Q4独立地为H和C1‑
C6烷基，所述烷基任选被卤素、OH、硝基或苯基取代，R1是岩藻糖基或H，R2是岩藻糖基或H，R3选自H、唾液酸基、N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基和乳
‑
N
‑
二糖基基团，其中N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基基团任选地携带包括一个或多个N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基和/或一个或多个乳
‑
N
‑
二糖基基团的糖残基；N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基和乳
‑
N
‑
二糖基基团中的每一个任选地被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，R4选自H、唾液酸基和N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基基团，其任选被包括一个或多个N
‑
乙酰基
‑
乳糖胺基和/或一个或多个乳
‑
N
‑
二糖基的糖残基取代；N
‑
乙酰基
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：格礼卡姆股份公司，
类型：发明
国别省市：