二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用技术方案

本发明专利技术公开了二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用。本发明专利技术发现DADS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的双组分系统，具有抑制其毒力因子的活性，因此可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒力因子的药物。

Application of diallyl disulfide in the preparation of two-component system drugs for the inhibition of Pseudomonas aeruginosa

【技术实现步骤摘要】
二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用
：本专利技术属于微生物
，具体涉及二烯丙基二硫醚在抑制铜绿假单胞菌双组分系统中的应用。
技术介绍
：双组分系统也被称为双组分信号转导系统，能使细菌感知、响应和适应环境或细胞内的变化。双组分系统负责环境信息处理和信号转导，同时调控着细菌一些毒力基因和毒力因子的表达。大蒜是常见的食物，其用作民间医药的历史已有几千年。现代科学研究证明，大蒜精油中含硫化合物具有较强的抗菌消炎作用，对多种细菌、真菌和病毒均有抑制作用。二烯丙基二硫醚(Diallyldisulfide，DADS)是大蒜精油中一种含硫丰富的化合物。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用。本专利技术通过实验表明，DADS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的双组分系统，具有抑制其毒力因子的活性。因此，本专利技术提供二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用。本专利技术发现DADS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的双组分系统，具有抑制其毒力因子的活性，因此可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒力因子的药物。附图说明：图1是DADS作用下铜绿假单胞菌双组分系统的KEGG通路图及其基因的差异表达。图2是DADS作用下铜绿假单胞菌双组分系统的KEGG通路图及其蛋白的差异表达。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：PAO1菌[铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)]悬液的制备：将指数生长期的PAO1培养液取样，离心，用PBS缓冲液洗涤一次，重悬于PBS中，并将菌浓度稀释至108CFU/mL。1.高通量RNA测序技术分析DADS对铜绿假单胞菌PAO1转录组的影响将指数生长期且浓度为108CFU/mL的铜绿假单胞菌PAO1接种到50ml的LB培养基上，接着加入浓度为0(对照)或者0.64mg/mL的DADS，实验设置三个平行。将6个实验组都放在37℃的水浴恒温振荡器中以180rpm振荡培养5h。对三个对照组和三个DADS处理组的细胞取样离心，然后将细胞沉淀物分别在-80℃速冻。1.1RNA样品制备根据制造商的协议，用TRIZOL试剂(赛默飞世尔科技公司，美国)从细胞样品中分离总RNA。使用纳米分光光度计(IMPLEN公司,加利福尼亚州，美国)测定RNA纯度，所有RNA样品的A260:A280比值均为1.8到2.0之间。用Qubit2.0荧光定量仪结合RNA定量分析试剂盒检测RNA浓度(美国生命技术公司，加利福尼亚州，美国)。安捷伦2100生物芯片分析系统及其配套试剂RNANano6000AssayKit检测RNA样品的完整性(安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国)；所有样品的RNA完整性均大于7.0。1.2特异链的文库构建转录组测序RNA测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成(北京，中国)。每个样品共需3ugRNA作为RNA样品制备的原料。测序文库是根据制造商的建议，并将索引码添加到每个样本的属性序列中，使用Illumina的NEBNext超定向RNA文库预备试剂盒(纽英伦生物技术有限公司，美国)生成的。简而言之，利用多聚T寡核苷酸磁珠从总RNA中纯化mRNA。用一种特殊的试剂盒从mRNA中分离出rRNA。并在NEBNext第一链合成反应缓冲液(5×)中，用二价阳离子使其被高温破碎。cDNA第一链用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNaseH)合成。随后，用DNA聚合酶I和RNaseH合成cDNA第二链。采用Phusion高保真DNA聚合酶、PCR通用引物和Index引物进行PCR扩增。最后，对产品进行纯化(核酸纯化系统)，并用安捷伦2100生物芯片分析系统对样品库质量进行评估。RNA测序由北京诺禾致源科技股份有限公司在Illumina测序平台完成。读取参考基因组图谱，新基因和基因结构分析，基因表达水平的定量参考基因组和基因模型注释文件直接从NCBI1基因组网站下载。使用bowtie2-2.2.3构建参考基因组索引并将cleanreads比对到参考基因组。Rockhopper被用来识别新基因、操纵子和转录起始位点。该系统可以高效准确地分析细菌RNA序列数据，从而辅助分析细菌转录组。然后，利用时延神经网络(TDNN)提取转录起始位点上游700个碱基对，进行启动子预测。HTSeqv0.6.1被用来计算每个基因对应的reads个数，基于基因的长度和基因的reads计数计算出了每一百万个片段中对应到外显子的每一千个碱基上的reads个数(FPKM)。1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE004091.2差异表达基因的差异表达分析及GO富集分析和KEGG通路分析用DESeqR包(1.18.0)进行组间差异表达分析，通过使用Benjamini和Hochberg的方法控制伪发现率，调整得到的p值。经DESeq鉴定，基因的校正p值<0.05，则为差异表达。用GOSeqR包对差异表达基因进行基因本体论(GO)功能富集分析，纠正基因长度偏差。GO术语校正p值<0.05被视为差异表达基因显著富集。《京都基因与基因组百科全书》KEGG数据库是一种从分子水平信息了解各种生物系统功能和属性的资源库，特别是指通过基因组测序等高通量实验技术生成的大规模分子数据集2。用KOBAS软件进行差异表达基因KEGG通路富集分析。2http://www.genome.jp/kegg/1.3注册号RNA序列数据集可以在NCBI基因表达综合数据库(GEO)中找到，检索号为GSE118801。2.iTRAQ高通量测序技术分析DADS对铜绿假单胞菌PAO1蛋白质组的影响为了研究DADS对铜绿假单胞菌蛋白质组的影响，将浓度为108CFU/mL的指数生长期的铜绿假单胞菌PAO1接种到50mL的LB培养基样品中。接着加入浓度为0(对照)或者0.64mg/mL的DADS，实验设置三个平行。将6个实验组都放在37℃的水浴恒温振荡器中以180rpm振荡培养5h。对三个对照组和三个DADS处理组的细胞取样离心，然后将各个实验组的细胞沉淀物在-80℃速冻。2.1样品制备和iTRAQ标记用RIPA裂解液获取蛋白提取物。根据制造商的协议，以BSA为标准品(BCA试剂盒，生物技术)，采用Bradford法测定蛋白浓度。iTRAQ蛋白测序分析由广州辉骏生物科技有限公司(广州，中国)完成。采用FASP法进行蛋白酶切(Wisniewski等人，2009；Lan等人，2012；Kambiranda等人，2014)。按照用户手册，使用iTRAQreagents–8plexKit本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌双组分系统药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文茹，曾桃花，谢小保，施庆珊，李彩玲，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44