针对现有纤维素乙醇制备技术中所存在的纤维素水解液中抑制物抑制发酵问题、木糖不能全部转化问题、葡萄糖抑制木糖发酵问题、纤维素酶作用温度与微生物发酵温度不一致的问题，本发明专利技术提供了一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其包括菌种的培养，木糖发酵、添加纤维素酶、同步糖化发酵等步骤。本发明专利技术采用基于一种乙酸和木糖共利用的马克斯克鲁维酵母菌株实现木糖和抑制物的同时利用，免去抑制物脱除的难题；采用高温的同步糖化发酵，免除了纤维素酶与发酵温度不匹配的问题，与现有纤维素乙醇发酵技术相比，实现了生产成本的显著降低。
A fermentation method of producing xylitol and ethanol from raw materials of non detoxified cellulose
【技术实现步骤摘要】
一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，具体地，其是利用纤维素原料采用两步发酵法生产木糖醇和乙醇的方法。
技术介绍
过去三十年来，由于全球工业化快速发展，城市化进程加快，全世界对能源的需求翻倍[PoppJ,BiofuelsandTheirCo-ProductsasLivestockFeed:GlobalEconomicandEnvironmentalImplications[J].Molecules,2016,21(3):285.]，不可再生的石油资源面临的枯竭问题也日趋凸显。其次，化石燃料的燃烧产生大量温室气体，加剧环境污染等问题。截止到2015年，空气中的CO2浓度较中世纪提高了40％，其中大部分来自于化石燃料的燃烧。对于能源的需求日益增长，促使人们大力发展绿色可持续的能源。燃料乙醇因具有较高的能量密度、易于运输、可再生性好等特点成为目前全世界最主要的生物能源之一，也是目前发展最快、应用最成熟的生物能源。纤维素原料来源广泛、价格低廉，是生产燃料乙醇的最佳选择。除可降低生产成本外，还可显著降低温室气体的排放、利于农村经济，提高农民收入。尽管在全球范围内已经进行了数十年的研发工作(例如中国专利201110304843.7、201210572124.8、201710181161.9、201711472264.7、201710004115.1、201410765651.X、201710198921.7、201510081638.7、201710897535.7、201810939170.4)，但仍然缺少具有经济竞争力的纤维素原料水解和发酵方法。纤维素乙醇的发展面临着一些问题仍未解决，诸如：①纤维素原料不能被微生物直接利用，需要对原料进行预处理，但是预处理过程产生的抑制物影响后续发酵。虽然可以通过水解液脱毒的方法来改善，但是提高了生产成本并且产生废水污染环境；②目前的乙醇生产菌株不能利用纤维素物料中半纤维素的水解物木糖和阿拉伯糖。虽然通过基因工程的手段改造菌株，使其能够利用木糖，但是重组菌在真实水解液中的发酵表现不能满足工业生产要求，糖利用率和产物得率较低；③目前最优的发酵工艺为同步糖化发酵，但菌株的发酵温度与纤维素酶的最适温度差距较大，纤维素酶用量大，成本较高[OjedaK,Energyanalusisandprocessintegrationofbioethanolproductionfromacidpretreatedbiomass:comparisionofSHF,SSFandSSCFpathways[J].ChemicalEngineeringJournal,2011,176-177(3):195-201.]。近年来，非传统工业酵母如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)(SilvaGM,EthanolproductionfromsugarcanebagasseusingSSFprocessandthermotolerantyeast[J].TransactionsoftheASABE,2015,58(2):193-200.8-9)(CongDu,TheproductionofethanolfromlignocellulosicbiomassbyKluyveromycesmarxianusCICC1727-5andSpathasporapassalidarumATCCMYA-4345。AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2019,103:2845–2855)在纤维素乙醇生产领域受到了越来越多的关注。相比于酿酒酵母S.cerevisiae，这个非传统工业酵母具有良好的乙醇生产应用潜质，表现出显著的高温、高浓度乙酸、糠醛等多压力耐受性及良好的底物及产物耐受性。我们通过微生物诱变和长期驯化选育，获得了一种乙酸和木糖共利用的马克斯克鲁维酵母菌株菌株，生物保藏编号为：CGMCCNo.16757(专利CN109593662A)。在这基础上，利用该菌株，开发了针对未脱毒纤维素水解液的两步法发酵，能够将水解液中的木糖转化为木糖醇，将水解液中的葡萄糖转化为乙醇，解决了水解液中抑制物抑制发酵问题、木糖不能全部转化问题、葡萄糖抑制木糖发酵问题、纤维素酶作用温度与微生物发酵温度不一致导致用量多等问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种能够在未脱毒及高温下条件下发酵纤维素水解液联产木糖醇乙醇和的方法，提高了糖利用率、降低了纤维素酶用量，大大降低纤维素乙醇生产成本。本专利技术的技术方案为：一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，包括以下步骤：步骤1)取马克斯克鲁维酵母1727-5菌种进行种子培养、扩大培养；步骤2)将纤维素物料进行预处理，获得未脱毒纤维素处理液，在未脱毒纤维素处理液中，料液比为1：3～1：10；步骤3)将经过步骤1)种子培养、扩大培养后的菌种接种至步骤2)中获得的未脱毒纤维素处理液中进行发酵，其中，初始菌种浓度OD620＝1-20，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，0～2vvm的微量通入无菌空气，以获得木糖醇；步骤4)步骤3)中进行发酵48-72h后添加纤维素酶，纤维素酶用量10FPU/g～20FPU/g，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，发酵96～144h得到乙醇。在一个具体的实施方案中，在步骤4)中进行批式补料发酵，以提高终点乙醇浓度：在添加纤维素酶后每24-48h补加步骤2)中预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖，使预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖在发酵液中的浓度为50-200g/L。在一个具体的实施方案中，在步骤1)中：种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5菌株接种至所述种子液培养基，培养16～24h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；扩大培养：将酵母浸粉取10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L以及木糖10g/L经121℃、20min灭菌制备得到扩培培养基，按接种量5-10％(v/v)将种子培养中获得的菌液接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30℃，转速100-300rpm，培养时间36～48h至菌种浓度达到OD620至2～4。在一个具体的实施方案中，在步骤2)中所述的纤维素物料选自玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理选自碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理中的一种或多种的组合。在一个具体的实施方案中，步骤3)中，可通过使用螺旋型搅拌桨提高搅拌效率。在一个具体的实施方案中，步骤4)中，发酵温度为40-50℃。在一个具体的实施方案中，将经步骤1)扩大培养后的菌种经离心浓缩，无菌水重悬，控制OD620＝1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1)取马克斯克鲁维酵母1727-5菌种进行种子培养、扩大培养；/n步骤2)将纤维素物料进行预处理，获得未脱毒纤维素处理液，在未脱毒纤维素处理液中，料液比为1：3～1：10；/n步骤3)将经过步骤1)种子培养、扩大培养后的菌种接种至步骤2)中获得的未脱毒纤维素处理液中进行发酵，其中，初始菌种浓度OD
【技术特征摘要】
1.一种利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)取马克斯克鲁维酵母1727-5菌种进行种子培养、扩大培养；
步骤2)将纤维素物料进行预处理，获得未脱毒纤维素处理液，在未脱毒纤维素处理液中，料液比为1：3～1：10；
步骤3)将经过步骤1)种子培养、扩大培养后的菌种接种至步骤2)中获得的未脱毒纤维素处理液中进行发酵，其中，初始菌种浓度OD620＝1-20，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，0～2vvm的微量通入无菌空气，以获得木糖醇；
步骤4)步骤3)中进行发酵48-72h后添加纤维素酶，纤维素酶用量10FPU/g～20FPU/g，发酵温度30-50℃，转速100-300rpm/min，pH值4-6，发酵96～144h得到乙醇。
2.根据权利要求1所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤4)中进行批式补料发酵，以提高终点乙醇浓度：在添加纤维素酶后每24-48h补加步骤2)中预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖，使预处理的纤维素或淀粉糖化后的葡萄糖在发酵液中的浓度为50-200g/L。
3.根据权利要求1或2所述的利用未脱毒纤维素原料生产木糖醇和乙醇的发酵方法，其特征在于，在步骤1)中：
种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经121℃、20min灭菌制备得到种子液培养基，将马克斯克鲁维酵母1727-5菌株接种至所述种子液培养基，培养16～24h至菌种浓度达到OD620至2～2.5；
扩大培养：将酵母浸粉取10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L以及木糖10g/L经121℃、20min灭菌制备得到扩培培养基，按接种量5-10％(v/v)将种子培养中获得的菌液接种到含有扩培培...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁文杰，杜聪，李益民，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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