敲除斑马鱼p2rx2基因的方法技术

本发明专利技术涉及基因敲除技术领域，尤其涉及敲除斑马鱼p2rx2基因的方法。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼p2rx2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成特异性sgRNA和Cas9‑mRNA用于斑马鱼的基因编辑。本发明专利技术能更高效且更精确地沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，本发明专利技术还提供了基因敲除选育p2rx2基因缺失型斑马鱼的方法，该方法构得的斑马鱼模型，有助于进一步揭示耳泡以及毛细胞形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上先天性耳聋致病机理的理解和基因矫正的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

The method of knocking out p2rx2 gene of zebrafish

【技术实现步骤摘要】
敲除斑马鱼p2rx2基因的方法
本专利技术涉及基因敲除
，尤其涉及敲除斑马鱼p2rx2基因的方法。
技术介绍
p2rx2基因位于斑马鱼第5号染色体上，包含12个外显子和11个内含子，cDNA全长1292bp，编码400氨基酸，p2rx2包含有4个进化上保守的功能结构域，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现p2rx2在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是耳泡中强烈表达。P2RX2基因突变可引起非综合征型常染色体显性遗传性耳聋(DFNA41)，P2RX2基因为噪声易感基因的候选基因，患者对噪声高度敏感。斑马鱼与人类耳道发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且p2rx2基因进化上较为保守，研究发现p2rx2在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。因此，通过干扰掉斑马鱼体内的p2rx2基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示耳道形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上耳道疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。且干扰掉p2rx2基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示耳泡以及毛细胞形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上先天性耳聋致病机理的理解和基因矫正的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。但是目前通用的检测CRISPR/Cas9突变方法应用于斑马鱼的基因敲除存在一定的缺陷，例如：在F0代对斑马鱼进行剪尾，并且做TA克隆，Sanger测序，需要花费大量的时间、试剂以及测序成本，并且F0代测序得到的不一定能够遗传到下一代。并且，CRISPR/Cas9技术所需的步骤较多，成本太高，脱靶率相对也较高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供敲除斑马鱼p2rx2基因的方法，该方法采用cloningfree策略进行斑马鱼p2rx2基因的敲除，脱靶率较低。本专利技术提供了靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA，包括启动子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术所述启动子元件的序列如SEQIDNO:3所示；所述骨架序列如SEQIDNO:4所示。在一些具体实施例中，所述靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA包括SEQIDNO:5～6所示的两条gRNA。本专利技术所述的靶序列针对斑马鱼p2rx2基因的3号外显子进行设计，本专利技术共设计了两个编辑的靶位点，分别为靶位点a和靶位点b。靶位点a(利用T7启动子进行转录)的选择遵循以下标准：5’-(N)20-NGG-3’，保证靶位点的3’端是NGG；靶位点b选择遵循以下标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，保证靶位点的3’端是NGG；靶点的选择位置在p2rx2基因的茎环区域内。本专利技术所设计的靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA具有更好的特异性，相对于其它gRNA而言，采用本专利技术设计的gRNA脱靶率较低，配合cloningfreeCRISPR/Cas9获得了良好的斑马鱼p2rx2基因的敲除效果。本专利技术中，所述靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA的制备方法包括：步骤1：以合成的DNA为模板，分别以两对特异性引物进行扩增，获得双链DNA；步骤2：将所述双链DNA进行转录后，纯化过得gRNA。其中，合成的DNA的序列如SEQIDNO:10所示。扩增获得SEQIDNO:5所示gRNA的特异性引物中，上游引物如SEQIDNO:11所示；下游引物如SEQIDNO:13所示；扩增获得SEQIDNO:6所示gRNA的特异性引物中，上游引物如SEQIDNO:12所示；下游引物如SEQIDNO:13所示。所述转录的体系包括：本专利技术还提供了靶向斑马鱼p2rx2基因的敲除试剂，其包括本专利技术所述的gRNA和Cas9mRNA。本专利技术中，所述Cas9mRNA针对斑马鱼进行密码子优化，序列如SEQIDNO：9。本专利技术中，所述敲除试剂中包括NucleasefreeH2O和如下浓度的：MgCl210mmol/L；Cas9mRNA150ng/μL；gRNA各20ng/μL。本专利技术所述的敲除试剂在构建p2rx2基因缺失型斑马鱼模型中的应用。本专利技术还提供了一种构建p2rx2基因缺失型斑马鱼模型的方法，其将所述的敲除试剂接入一细胞期的斑马鱼受精卵内，孵化获得p2rx2基因缺失型斑马鱼模型。本专利技术中，每个受精卵给予1.5～2.0nL所述的敲除试剂。一些实施例中，每个受精卵给予1.8nL所述的敲除试剂所述孵育后还包括筛选的步骤；所述筛选包括：对受精36h后的胚胎进行筛选，或对成鱼进行筛选；所述筛选包括对基因组DNA进行扩增后进行Sanger测序或根据电泳结果进行筛选；扩增产物包含227bp和322bp大小的条带则p2rx2基因缺失，扩增产物仅有322bp大小的片段则p2rx2基因未缺失；所述扩增的引物序列如SEQIDNO:7～8所示。所述孵化获得的p2rx2基因缺失斑马鱼为F0代；所述方法还包括传代的步骤；F1代斑马鱼由F0代斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交获得；F2代斑马鱼由F1代突变体杂交获得。本专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的p2rx2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度150ng/μL)，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养36h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。本专利技术能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，且干扰掉p2rx2基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示耳形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上对耳聋疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA，包括启动子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.靶向斑马鱼p2rx2基因的gRNA，包括启动子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所示的gRNA，其特征在于，所述启动子元件的序列如SEQIDNO:3所示；所述骨架序列如SEQIDNO:4所示。


3.根据权利要求1所示的gRNA，其特征在于，包括SEQIDNO:5～6所示的两条gRNA。


4.靶向斑马鱼p2rx2基因的敲除试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的gRNA和Cas9mRNA。


5.根据权利要求4所述的敲除试剂，其特征在于，敲除试剂中包括NucleasefreeH2O和如下浓度的：
MgCl210mmol/L；
Cas9mRNA150ng/μL；
gRNA各20ng/μL。


6.权利要求4或5所述的敲除试剂在构建p2rx2基因缺失型斑马鱼模型中的应用。


7.一种构建p2rx2基因缺失...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢鼎华，赖若沙，谢华平，董运鹏，谢缤灵，付贵芳，曾婷，杜涵，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43