一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术发明专利技术人鉴定并证实了miRNA‑T21可以通过抑制OsCYS1及OsPAO4的表达以调控半胱氨酸的合成和H

A miRNA related to rice blast resistance, its corresponding precursor and Application

【技术实现步骤摘要】
一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)侵染引起的稻瘟病，是水稻生产上的重要限制因素。根据不同的感染部位，稻瘟病可以分为叶瘟、节瘟、穗颈瘟以及谷粒瘟等，其中以叶瘟和穗颈瘟的危害最大，严重时可造成水稻严重减产甚至绝收。长期的生产实践证明，鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种成为了防治稻瘟病最为经济有效的策略。目前已有超过100个稻瘟病完全抗性位点被定位，24个主要抗稻瘟病基因被克隆。它们主要分布在除3号染色体外的其它11条染色体上。其中，第6号、第11号和第12号染色体分别存在一个很大的抗病基因簇。结合分子标记辅助选择(MAS)技术，大量抗病新品种被选育成功，但这些仍不能彻底解决稻瘟病对水稻的严重威胁，旧的问题与新的挑战并存。首先，从抗病机理上来看，水稻-稻瘟病菌互作机理的认识仍不十分明确，极大了限制了育种工作的进程。其次，单一抗病基因的频繁应用，会加速优势生理小种的进化，造成育成品种抗性逐年递减，3-5年后抗性即会消失，带来品种推广使用难以持久的问题。因此急需发现新的优异抗病资源或者将近些年的新方法新技术用于抗病育种工作中，为抗病育种拓展新的研究方向。MicroRNA(miRNA，微小RNA)是一类长度约20-24个核苷酸(nucleotide，nt)的内源单链非编码小分子RNA，它通过与RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合，以碱基互补配对方式切割靶基因mRNA、抑制mRNA的翻译或介导靶基因DNA甲基化来调控基因的表达(Zhangetal.，2006；Boosanietal.，2015)。近年来研究发现miRNA作为一个重要的调控因子，广泛参与植物的抗病防御反应过程，它们可能通过抑制或激活某些靶基因的表达以调节植物信号传导途径、激活抗病途径相关转录因子及调控植物体内的各种代谢途径等方式来参与植物抗病反应途径(Lietal.，2010；Lietal.，2014；Guptaetal.，2014；Wuetal.，2015；Zhangetal.，2015；Lietal.，2017；Wuetal.，2017)。miRNA的调控与各个层级的抗病反应途径具有重要关系，如miRNA能够调控某些抗病途径中的关键靶基因来抵御病菌的入侵。王兴军等专利技术的“利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法及其专用双链RNA，我们也在前期公开了“一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用”(中国专利201711155567.6)，该miRNA主要靶向负调控抗病基因Pik-H4来调控抗病性，这些研究表明miRNA可用于增强植物抗病性。因此，进一步克隆与分析稻瘟病抗病反应相关的miRNA不仅在不同分子水平上丰富植物抗病机理，还可通过利用miRNA来指导抗病育种，为解决作物抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种与稻瘟病抗性相关的miRNA。它通过抑制靶基因OsPAO4及OsCYS1的表达以调控H2O2的积累和半胱氨酸的合成从而负调控稻瘟病抗性。本专利技术的另一目的在于提供上述与稻瘟病抗性相关的miRNA的应用。敲除及靶模拟该miRNA能显著增强稻瘟病抗性，可结合CRISPR/Cas9基因编辑技术对miRNA进行定点编辑以提高水稻的稻瘟病抗性。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，其核苷酸序列如下所示：GGAGGGAGAGGAAGAAGAUGGGC。编码上述与稻瘟病抗性相关的miRNA的基因，其核苷酸序列如下所示：GGAGGGAGAGGAAGAAGATGGGC。上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体，其核苷酸序列如下所示：ACAAAAGUGAGGAGGGAGAGGAAGAAGAUGGGCGAUGACAAGAAGGUUAUAGUAGUAUAUCGACUUUGCUUCUUCUUUUUUUUUUCAGUUUCUA。编码上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体的基因，其核苷酸序列如下所示：ACAAAAGTGAGGAGGGAGAGGAAGAAGATGGGCGATGACAAGAAGGTTATAGTAGTATATCGACTTTGCTTCTTCTTTTTTTTTTCAGTTTCTA。上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体在培育抗稻瘟病水稻中的应用。所述的应用，是利用基因工程技术，通过抑制所述的miRNA在水稻中的表达，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。所述的基因工程技术优选为CRISPR/Cas9技术。一种利用CRISPR/Cas9技术培育抗稻瘟病水稻的方法，包括如下步骤：合成上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应前体的敲除序列，将其构建到载体上得到敲除载体，采用农杆菌介导转化水稻，从而得到抗稻瘟病水稻；具体包括如下步骤：(1)根据上述与稻瘟病抗性相关的miRNA和其相应的前体的序列设计两个靶点，根据靶点序列分别合成接头引物U3和U6a；(2)将引物U3和U6a的正反向接头引物退火形成双链，然后分别连接到BsaI酶切后的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA质粒片段上，并分别利用引物B1’/B2、B2’/BL进行扩增；(3)将扩增产物用BsaI酶切，将酶切片段纯化后连接到BsaI酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上，即构建成靶向所述的miRNA的敲除载体。(4)将步骤(3)得到的敲除载体转化水稻愈伤组织，经诱导获得再生苗，筛选得到阳性植株。步骤(1)中所述的引物U3的正向接头引物、反向接头引物序列分别如下所示：U3F：GGCAGGAATATACAAAAGTGAGGA；U3R：AAACTCCTCACTTTTGTATATTCC；步骤(1)中所述的引物U6a的正向接头引物、反向接头引物序列分别如下所示：U6aF：GCCGCATAGGACTATCGACCAAAG；U6aR：AAACCTTTGGTCGATAGTCCTATG。步骤(2)中所述的引物B1’/B2、B2’/BL分别如下所示：B1’:TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG；B2:AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC；B2’:TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG；BL:AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.编码权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


4.编码权利要求3所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。


5.权利要求1所述的与稻瘟病抗性相关的miRNA和/或其相应的前体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：利用基因工程技术，通过抑制所述的miRNA在水稻中的表达，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。


7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的基因工程技术为CRISPR/Cas9技术。


8.一种利用CRISPR/Cas9技术培育抗稻瘟病水稻的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王加峰，陈淳，黄明，王慧，刘永柱，郭涛，陈志强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44