一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统技术方案

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游片段、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，利用真菌操纵子基因间隔区序列连接目标基因，通过定点基因插入的方式将其插入到宿主细胞表达基因终止密码子的下游，利用靶基因的启动子完成目标基因的转录表达。该表达系统简化了实验操作步骤，提高了工作效率，增加了目标基因表达的可控性和稳定性，降低了多基因异源表达对已知启动子多样性的要求，对于利用合成生物学进行天然产物的挖掘、产量的提高以及非天然化合物的创造等方面具有较高的实际应用价值。

A fixed-point quantitative and timing expression system of foreign genes based on fungal operon

【技术实现步骤摘要】
一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统
本专利技术属于生物
，涉及一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统。
技术介绍
天然产物是现代药物创制的重要来源。然而，目前利用传统的筛选技术获得具有实用价值的新结构天然产物的难度越来越大，另外还有一部分已知的活性天然产物来源稀缺、天然含量低、组份复杂且难以完全分离。基因组测序技术的发展和天然产物合成途径的解析，为通过异源生物合成技术生产这些有价值的天然产物提供了可能。合成生物学技术以其“跨物种”转移功能元件以及模块的能力，逐渐成为解决这些问题的主要手段。目前，在基因组测序的基础上，利用合成生物学的方法已完成青蒿素前体青蒿酸、阿片类药物等重要活性天然产物在细胞工厂中的生产。酿酒酵母、构巢曲霉等真菌底盘细胞的遗传背景清楚，遗传操作相对于其它真核生物更为简单。与大肠杆菌、放线菌等原核生物类底盘细胞相比，来源于真核生物的生物合成酶在真菌中更容易成功表达并发挥其催化作用。在真菌中，基因是受独立调控并转录成单顺反子mRNA的，因此外源基因在其中的表达也需要以启动子-基因-终止子的模块形式进行。然而，天然产物的合成通常涉及到多基因的表达，这就需要为每一个基因提供单独的启动子和转录终止子，从而致使实验操作繁复、目标DNA片段过长。尤其是在目前可供选择的启动子数量有限的情况下，多基因的表达常常需要同一启动子和终止子的重复使用，这极大的增加了转化子内部基因同源重组的概率。2015年，首次在真菌中发现了操纵子结构。Yue等（YueQ,ChenL,LiY,BillsG,ZhangX,XiangM,LiS,CheY,WangC,NiuX,AnZ,LiuX.2015.FunctionaloperonsinsecondarymetabolicgeneclustersinGlarealozoyensis(Fungi,Ascomycota,Leotiomycetes).mBio6:e00703-15.）在重要抗真菌药物棘白菌素的产生菌Glarealozoyensis中识别并鉴定了真菌操纵子glpks3-glnrps7，其基因间隔区为26bp，二者在共同转录成1条成熟的双顺反子mRNA后直接翻译成2个蛋白。若将操纵子结构应用于真菌中多基因的异源表达，这将极大的降低目标DNA片段的长度，减少实验操作步骤，提高工作效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统。本专利技术的技术方案概述如下：一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，它利用真菌操纵子基因间隔区序列连接目标基因，通过基因插入的方式将其插入到宿主细胞表达基因终止密码子的下游，在不破坏原有基因（即靶基因）表达的情况下，利用靶基因的启动子完成目标基因的转录表达。本专利技术提供的技术方案是：一种操纵子基因间隔区，其序列是5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游片段、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，其中所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’相对应，优选的是5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’、5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。所述表达系统：在目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段之间还连接有筛选标记基因；所述目标基因是一个或多个，优选为2、3、4个。所述的表达系统适合于真菌或植物，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。本专利技术还提供一种含有所述操纵子，或所述表达系统的重组菌或重组植株。本专利技术还提供一种真菌操纵子基因间隔区在异源表达中的应用，所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’相对应，优选的是5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’、5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。上述的应用，所述异源表达是真菌或植物，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。同时，本专利技术还提供所述表达系统在表达异源基因中的应用，其是将所述表达系统转化到宿主中，实现异源基因的表达。具体而言，本专利技术的实施方案如下。1）真菌操纵子基因间隔区序列的确定。原始序列为5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’，基本序列为5’-CAATCAAAC-3’。优选序列为5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。2）根据真菌操纵子基因间隔区序列、目标基因序列、筛选标记基因序列和宿主靶基因序列设计引物，通过PCR对目标基因、宿主靶基因终止密码子的上下游片段和筛选标记基因进行扩增，进一步通过无缝克隆（或融合PCR）进行连接与克隆（或扩增），最终通过PCR获得含有宿主靶基因终止密码子上游片段（含终止密码子）-真菌操纵子基因间隔区-目标基因-筛选标记基因-宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段。3）通过转化将获得的DNA片段转入宿主细胞中，进行目标基因的定点插入。4）通过PCR对获得的转化子进行筛选，获得表达目标基因的阳性转化子。本专利技术的外源基因表达系统可用于真菌、植物等真核生物基因的异源表达，对于利用合成生物学进行天然产物的挖掘、产量的提高以及非天然化合物的创造等方面具有较高的实际应用价值。本专利技术的外源基因表达系统无需为目标基因单独提供启动子和转录终止子，在不破坏宿主细胞原有基因表达的情况下，可以将目标基因插入到宿主任一基因的下游，利用靶基因的启动子和终止子即可控制目标基因的转录表达。不仅简化了实验操作步骤，提高了工作效率，而且极大的增加了目标基因表达的可控性和稳定性，降低了多基因异源表达对已知启动子多样性的要求，极大的降低了目标DNA片段的长度。附图说明图1以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统的构建策略示意图。图2真菌操纵子基因间隔区的比较，其中（A）真菌操纵子基因间隔区序列和二级结构；（B）基因间隔区序列对下游基因表达的影响。图3LtLasS1和LtLasS2和HsOMT异源表达转化子中的DLD及其甲基化产物的生产。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种操纵子基因间隔区，其序列是5’-GAGTCAATCAAACACTC- 3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种操纵子基因间隔区，其序列是5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。


2.一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：
含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游片段、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，
其中所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：
5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’相对应，优选的是5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’、5’-GAGTCAATCAAACACTC-3’。


3.如权利要求2所述表达系统，其特征在于，在目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段之间还连接有筛选标记基因。


4.如权利要求2所述表达系统，其特征在于，所述目标基因是一个或多个，优选为2、3、4个。

【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉泉，岳群，张礼文，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11