一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰T细胞及用途制造技术

一种分离的结合CD19的嵌合抗原受体，基于CRISPR‑Cas9系统体外敲除T细胞中TRAC、B2M和PD‑1基因的方法，该方法中使用的crRNA以及根据该方法获得的基因敲除的T细胞及其用途。

An isolated chimeric antigen receptor and its modified T cells and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰T细胞及用途
本公开属于生物医药领域。具体地，涉及一种嵌合抗原受体、包含嵌合抗原受体的细胞以及其用途。
技术介绍
这里的陈述仅提供与本专利技术有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。淋巴系统恶性肿瘤包括淋巴细胞白血病和淋巴瘤，是发生在B细胞、T细胞及NK细胞等淋巴细胞上的肿瘤。目前在治疗上存在许多困难，特别是临床上常常遇到的疾病复发和难治。近10多年来，淋巴系统肿瘤的临床治疗取得了很大进展，抗CD20单抗广泛应用于CD20阳性的B细胞非霍奇金淋巴瘤，取得良好的疗效，已经成为临床一线用药。但是，由于有部分B淋巴瘤和急慢性B淋巴母细胞白血病的细胞不表达CD20，美罗华一类的抗CD20抗体对其无明显治疗作用，因此迫切需要一种新的治疗方法来提高淋巴瘤和急慢性淋巴细胞白血病的治愈率。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T或CART)，通过基因修饰使T淋巴细胞表达特定的CAR，该细胞可以特异性识别靶抗原，杀伤靶细胞。CAR-T细胞具备针对特定肿瘤抗原的高度亲和特性，从而能高效杀伤表达该抗原的肿瘤细胞。CD19在不同分化阶段的B淋巴细胞表面均有特异性表达，B细胞淋巴瘤和B淋巴细胞白血病均表达CD19抗原。因此，构建识别CD19嵌合抗原受体的CART细胞，可以达到对B淋巴细胞肿瘤有效治疗的目的。CD19-CART细胞能够识别B淋巴细胞白血病的特异性CD19靶点，通过释放穿孔素及颗粒酶等细胞因子，对表达CD19抗原的B淋巴细胞进行攻击，从而促使机体清除恶性淋巴细胞。美国斯隆-凯特琳癌症中心在治疗难治复发的急性B细胞型淋巴细胞性白血病(B-ALL)中应用了自体19-28zCAR-T技术，16例患者中14例获得完全缓解(CR)，甚至对移植后复发的费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(费Ph+ALL)也有效。通过CART治疗也为异体基因造血干细胞移植创造了条件。宾州大学也报告了应用19-CD137zCART治疗B细胞肿瘤结果，30例难治复发的B-ALL，27例获得CR，6个月无病生存率达67％，总生存率达78％。目前与宾州大学合作的诺华已经获得了全球第一个CART细胞治疗药物的针对儿童的复发/难治ALL的上市许可，其后Kite也获得第二个CAR-T药物针对非霍奇金淋巴瘤的上市许可。目前批准上市的CART产品都是由自体细胞制备生产，但是具有生产周期长、制备成本高、部分病人无法生产制备出合格CAR-T细胞的缺点，导致这一技术不能大面积地方便地应用于患者。而通用型CAR-T细胞(UCART)敲除了T细胞表面的TCR基因，因此可以消除或大大减少GvHD效应，另外敲除了B2M后可以减少宿主对异体细胞的排斥反应，同时异体UCART具有即用即取的特点，可以用固定剂量回输病人，避免了病人T细胞无法扩增或无法及时制备的缺点，且大规模制备的可以降低制造成本，适合大规模应用。WO2014186585A2、WO2016057821A2专利涉及敲除内源基因的方法；WO2009091826、WO2012079000A1、WO-2015187528、WO-2015158671、WO2016014789、WO2016014576、WO2017049166、WO2017173349涉及CAR-T细胞的制备及应用；WO2015136001、WO2015140268、WO2015158671、WO2015193406、WO2017032777涉及UCART的制备和应用，但目前只有Cellectis SA、Pfizer Inc和上海邦耀生物公司的UCART处于一期临床研究阶段，并没有UCART细胞治疗药物上市，因此，需要继续研究探索新的UCART细胞治疗药物。
技术实现思路
本公开的目的在于克服现有技术在免疫治疗中存在的问题，提供一种基因修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包含结合CD19的嵌合抗原受体的核酸，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除内源基因TARC、B2M。此外，本公开还提供了敲除内源基因TARC、B2M、PD-1使用的全新序列的crRNA，并提供了根据本公开的方法所获得的基因敲除的T细胞在治疗或预防CD19介导的疾病中的用途。本公开的一些实施方案提供一种TCR和PD-1或B2M双阴性T细胞及其构建方法方法。本公开的另一些实施方案提供一种TCR、B2M和PD-1三阴性T细胞及其构建方法。更进一步地，通过磁珠分选出上述TCR阴性T细胞、TCR和PD-1或B2M双阴性T细胞和TCR/B2M/PD-1三阴性T细胞，用于肿瘤的过继细胞免疫治疗等方面。在一些实施方案中，提供一种体外敲除T细胞中一个或多个靶基因的方法，所述方法包括如下步骤：1)使用靶向所述T细胞中的一个或多个靶基因的sgRNA分别与Cas9蛋白接触，形成蛋白RNA复合体(RNP)；2)将RNP与寡聚脱氧核糖核酸(N-oligo)或鱼精DNA片段混合后转化所述T细胞，其中所述sgRNA将Cas9蛋白分别引导至相应靶基因的靶序列，并且与所述靶序列杂交，其中所述靶基因被裂解，并且其中所述靶基因的裂解效率大于75％。在一些的实施方案中，所述靶基因选自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一个、更多个或其任意组合，所述sgRNA靶向所述靶基因的编码序列或其表达调控序列。进一步地，所述sgRNA从5’到3’依次由长度为17nt、18nt、19nt或20nt的靶向靶基因的crRNA和与Cas9蛋白对应的tracrRNA连接而成，其中所述crRNA的长度优选为17nt。在一些实施方案中，所述寡聚脱氧核糖核酸是长度为100bp、250bp及100-250bp之间的任意长度的双链DNA或长度为100nt、250nt及100-250nt之间任意长度的单链DNA，优选序列为SEQ ID NO：55所示的寡聚脱氧核糖核酸。在一些实施案中，所述靶向TRAC基因的crRNA选自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示crRNA中的任意一种或多种，优选如SEQ ID NO:37所示的crRNA；所述靶向B2M基因的crRNA序列如SEQ ID NO:49所示，所述靶向PD-1基因的crRNA选自SEQ ID NO:50、51和52所示的crRNA中的任意一种或多种，优选为SEQ ID NO：52所示的crRNA。在一些实施方案中，所述Cas9蛋白为来自酿脓链球菌的Cas9蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示，所述Cas9蛋白对应的tracrRNA序列如SEQ ID NO：53所示。在一些实施方案中，所述T细胞选自辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞、CAR-T细胞和TCR-T细胞。另一方面，本公开还提供根据上述方法获得的靶基因敲除的T细胞。另一方面，本公开还提供一些用于敲除TRAC基因的crRNA，所述crRNA靶向人TRAC基因的编码序列或其表达的调控序列，所述crRNA选自S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的嵌合抗原受体，其包括CD19抗原结合结构域，其中所述CD19抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180211 CN 2018101403968一种分离的嵌合抗原受体，其包括CD19抗原结合结构域，其中所述CD19抗原结合结构域包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。


如权利要求1所述的分离的嵌合抗原受体，其还包括共刺激信号传导区和/或CD3ζ信号传导结构域。


如权利要求2所述的分离的嵌合抗原受体，其中所述的共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其任意组合，优选氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示的4-1BB共刺激信号传导区。


如权利要求2或3所述的分离的嵌合抗原受体，其中所述的CD3ζ信号传导结构域包括如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。


如权利要求2至4中任一项所述的分离的嵌合抗原受体，其进一步包括细胞外铰链结构域，优选的，其中所述细胞外铰链结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的人CD8α前导信号区和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的人CD8α铰链区。


如权利要求5所述的分离的嵌合抗原受体，进一步包含CD8α跨膜结构域，优选的，其中所述CD8α跨膜结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。


如权利要求1至6中任一项所述的分离的嵌合抗原受体，其包括如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。


一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合抗原受体。


如权利要求8所述的分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核酸序列。


如权利要求9所述的分离的核酸分子，其包含编码共刺激信号转导区和/或CD3ζ信号传导结构域的核酸序列，优选地，所述编码共刺激信号转导区的核酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述的编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：56所示。


如权利要求10所述的分离的核酸分子，其进一步包含编码细胞外铰链结构域的核酸序列，优选的，其中所述编码细胞外铰链结构域的核酸序列包含如SEQ ID NO：5所示的人CD8α前导信号区和如SEQ ID NO：7所示的人CD8α铰链区。


如权利要求11所述的分离的核酸分子，其进一步包含如SEQ ID NO：9所示的CD8α跨膜结构域。


如权利要求8至12任一项所述的分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的编码CD19嵌合抗原受体的核酸序列。


一种载体，其包含权利要求8至13任一项所述的分离的核酸分子；优选的，其中所述载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体；最优选的，所述载体进一步包括启动子，优选如SEQ ID NO：4所示的EF-1启动子。


一种T细胞，其包含如权利要求8至13任一项所述的分离的核酸分子或权利要求14所述的载体或被遗传修饰以表达权利要求1至7任...

【专利技术属性】
技术研发人员：张华，沈连军，苏庆，陶维康，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，上海恒瑞医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32