一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。所述双信号肽来源于芽孢杆菌Sec途径中不同的信号肽的组合。本发明专利技术通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。

A double signal peptide for increasing the expression of foreign protein and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(Escherichiacoli)。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码偏爱性；生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合进行工程菌株改造等显著优势。基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前提蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，对在蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有15-60个氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点相结合，进而跨膜转运至胞外。因此，研究不同类型的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。
技术实现思路
本专利技术以Sec途径的信号肽为主，进行随机组合，以蔗糖异构酶、角蛋白酶和果聚糖蔗糖酶为目的蛋白进行表达。本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的第一个目的是提供一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，所述双信号肽来源于芽孢杆菌Sec途径中不同的信号肽的串联组合。优选地，所述来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽为SPDacB、SPamyE或SPL。优选地，所述信号肽SPDacB的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，来源于枯草芽孢杆菌1A747。优选地，所述信号肽SPamyE的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，来源于枯草芽孢杆菌168，其GeneID:938356GenBank:NC_000964.3(327618..329597)。优选地，所述信号肽SPL的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1，SPL是来源于果聚糖蔗糖酶自身的信号肽。本专利技术的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。优选地，编码所述信号肽SPDacB基因的的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选地，编码所述信号肽SPamyE基因的的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。优选地，编码所述信号肽SPL基因的的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的第三个目的是提供所述双信号肽在提高外源蛋白表达量中的用途。优选地，所述外源蛋白为蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶。优选地，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。优选地，所述角蛋白酶的编码基因为kerK，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。优选地，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，来源于分散泛菌。优选地，所述蔗糖异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，其GenBank：AY223549.1。优选地，所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，来源于地衣芽孢杆菌。优选地，所述果聚糖蔗糖酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其GenBank:CP034569.1。本专利技术的第四个目的是提供一种含有所述双信号肽的编码基因的重组载体。优选地，所述重组载体所用的表达载体为pWB980。本专利技术的第五个目的是提供一种含有所述重组载体或所述双信号肽编码基因的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)。更优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。所述菌株来源于文献(史超硕、李登科等。两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响[J].中国生物工程杂志.2019,39(10)：17-23。本专利技术的第六个目的是提供一种基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞，通过载体表达连接有所述双信号肽编码基因和外源蛋白基因。本专利技术的第七个目的是提供双信号肽的构建方法，步骤如下：构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。优选地，所述双信号肽的构建方法，步骤如下：将双信号肽的编码基因与含有外源蛋白基因的载体用相同的限制性内切酶进行双酶切，切胶回收，通过构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。本专利技术的第八个目的是提供所述蛋白的生产方法，步骤如下：将连接有所述双信号肽的基因工程菌经活化后，以1.5-2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于35-40℃、215-225r/min发酵培养15-50h。所述发酵产角蛋白酶的发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水。所述发酵产蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基组成为：酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：将所述基因工程菌接种于种子培养基中，35-40℃、215-225r/min振荡培养10-14h。所述种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽串联组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。2、本专利技术通过双信号肽串联组合，可以使蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。附图说明图1是角蛋白酶的PCR产物电泳图；图2是合成的果聚糖蔗糖酶基因双酶切示意图；图3是合成的蔗糖异构酶基因双酶切示意图；图4是外源蛋白的目的基因构建示意图；图5是信号肽构建示意图，其中SPN代表单、双、三信号肽串联组合；图6是中B.subtilisWB600表达角蛋白酶的SDS-PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP-D-A为利用双信号肽串联组合表达的角蛋白酶；图7是角蛋白酶单双信号肽酶活示意图，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP-D-A为利用双信号肽串联组合表达的角蛋白酶；图8是B.subtil本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，其特征在于：所述双信号肽组合是由氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的信号肽中的任意两种不同信号肽的串联组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，其特征在于：所述双信号肽组合是由氨基酸序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示的信号肽中的任意两种不同信号肽的串联组合。


2.编码权利要求1所述信号肽的基因。


3.权利要求1所述双信号肽组合在提高蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶表达量中的用途。


4.如权利要求3所述双信号肽组合在提高蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶表达量中的用途，其特征在于：
所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示；所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，路福平，李登科，王兴吉，彭冲，刘逸寒，王克芬，张会图，刘文龙，刘夫锋，张杰，佟新伟，
申请(专利权)人：天津科技大学，山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12