一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于大麻肽(r)VD‑Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用，即基于(r)VD‑Hpα的N末端序列与神经肽FF的C末端序列构建而成的全新嵌合肽VF‑11和VF‑13。与现有技术相比，本发明专利技术具有如下优势：(1)与已报道的(r)VD‑Hpα及(m)VD‑Hpα相比，VF‑11和VF‑13在体内的镇痛活性有所加强，产生了比母体分子更有效的镇痛效果。(2)VF‑11和VF‑13解决了经典大麻类激动剂以及母体分子存在的镇痛耐受的问题，产生了无耐受形式的镇痛效果，可用于急性痛和病理性疼痛的治疗。

A chimeric peptide based on cannabinoid (R) VD HP \u03b1 and neuropeptide FF and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用
本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用。
技术介绍
疼痛是人类进化过程中为保护自身完整性而形成的一种感觉机制。然而，一些慢性、难治愈的疼痛严重影响人们的生活质量，在临床治疗中存在极大的挑战。大麻类物质被用于疼痛的治疗已有几千年的历史(JPsychoactiveDrugs.1981,13(1):23；PainResManag.2001,6(2):80)。生物体内的大麻系统主要包括两种大麻受体(CB1受体和CB2受体)，内源性大麻配体以及相关的代谢酶类。CB1受体在全身的分布范围较广，尤其在中枢神经系统分布最多；CB2受体的分布区域相对比较保守，主要在免疫细胞和组织中表达(AdvClinExpMed.2007,16(6):807)。经典的内源性大麻配体包括花生四烯乙醇胺(AEA)(Science.1992,258(5090):1946)和花生四烯酰甘油(2-AG)(BiochemPharmacol.1995,50(1):83)。研究表明，大麻系统在疼痛调节过程中扮演重要的角色。2003年，来源于血红蛋白α链的片段hemopressin(PVNFKFLSH-OH)被首次鉴定(JBiolChem.2003,278:8547)。Hemopressin对于急性疼痛和病理性疼痛均可产生明显的镇痛效果(ProcNatlAcadSciUSA.2007,104(51):20588；Peptides.2005,26(3):431)。VD-hemopressin(α)(VD-Hpα)是体内存在的hemopressin的N末端延伸片段，在体外功能实验中表现为CB1受体的激动剂(FASEBJ.2009.23:3020)。不同种属哺乳动物体内VD-Hpα之间存在很高的氨基酸序列同源性(Neuropeptides.2017,63:83)。进一步的药理学研究表明，中枢注射VD-Hpα可以在小鼠不同临床前痛模型中产生明显的镇痛作用。此外，VD-Hpα参与到心血管调节、摄食、运动活性、胃肠运动和体温调节等生理过程。然而，与经典的大麻配体WIN55,212-2一样，侧脑室连续注射VD-Hpα产生明显的耐受现象(Neuropeptides.2017,63:83；JPharmacolExpTher.2014,348:316)。神经肽FF(NPFF)于1985年被首次在牛脑中分离。NPFF系统包括两种受体前体(Pro-NPFFA和NPFFB)和两种受体(NPFF1和NPFF2)(FEBSLett.1997,409:426；MolPharmacol.1999,55:804)。研究表明，NPFF系统参与体内多种生理过程，例如摄食、体温和胃肠运动。此外，NPFF作为一种内源性肽类配体对阿片诱导的镇痛、耐受和成瘾产生显著的调节效果。近年来的药理学研究表明，NPFF不仅表现出抗阿片活性，而且其对大麻类物质的镇痛以及耐受和便秘副作用也有明显的调节作用(EurJPharmacol.2015,767:119；AnesthAnalg.2015,121:1360)。因此，NPFF对大麻的调节作用使两者作为化学模板分子来发展全新嵌合肽。本课题组在专利201310087565.3中公开了一种内源性大麻肽类激动剂(m)VD-Hpα(VDPVNFKLLSH-OH)在制备镇痛药物中的应用。药理学实验结果表明：该内源性大麻肽类配体在光热甩尾实验中表现出较强的中枢镇痛活性，并具有对体温、胃肠功能和运动活性影响小的优点。然而，(m)VD-Hpα的镇痛效果仍不理想，且长期给药过程中会出现明显的镇痛耐受现象。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种镇痛效果好、副作用低的基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述嵌合肽的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述嵌合肽的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽，其是以大麻肽(r)VD-Hpα(VDPVNFKFLSH-OH)和NPFF(FLFQPQRF-NH2)的关键药效团为化学模板构建而成的，其N末端为大麻肽(r)VD-Hpα的“关键药效团”，C末端为NPFF的“关键药效团”，其具有式Ⅰ所示的氨基酸序列，Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaa11-Arg-Phe-NH2(Ⅰ)；其中，Xaa10和Xaa11同时缺失，或Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代。优选地，当Xaa10和Xaa11同时缺失时，所述的嵌合肽具有式Ⅱ所示的氨基酸序列，嵌合肽标记为VF-11。Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Arg-Phe-NH2(Ⅱ)优选地，当Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代时，所述的嵌合肽具有式Ⅲ所示的氨基酸序列，嵌合肽标记为VF-13。Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(Ⅲ)上述嵌合肽的制备方法包括如下步骤：(1)采用Fmoc固相合成法制备多肽：(i)树脂预处理：先溶胀氨基树脂，减压抽干，洗涤；(ii)脱除Fmoc基团保护，茚检；(iii)氨基酸的缩合：脱保护后，将第一个N-α-Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Aa)与脱保护后的氨基树脂进行缩合反应，茚检确认缩合成功；再脱保护并洗涤，茚检确认脱保护完全；(iv)肽链的延长：然后缩合第二个氨基酸，重复以上步骤，由C端向N端，直至多肽链合成完成；(2)用切割剂将步骤(1)合成完成的多肽链进行切割，过滤，将滤液，即切割液减压旋干，加入冰乙醚析出沉淀，用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，冷冻干燥得白色粗肽粉末；并通过反相高效液相色谱将粗肽进一步分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到多靶点多肽产品。步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide树脂，优选Rink-Amide-MBHA树脂；所述的溶胀为将氨基树脂置于二氯甲烷中按照60～100rpm的速率搅拌10～40min，优选80rpm，搅拌30min，使树脂充分溶胀；二氯甲烷与氨基树脂的体积质量比为8～12mL/g，优选10mL/g；所述的洗涤为加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，每次3min。步骤(1)中，所述的脱保护为将处理后的氨基树脂置于混合溶液中，一次搅拌，重复1～4次，优选2次，抽干；再置于混合溶液中，二次搅拌，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤4次，以清除残余的哌啶，得到脱除Fmoc保护基团的树脂。其中，所述的混合溶液为哌啶、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一碳-7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅰ所示的氨基酸序列，/nVal-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaa11-Arg-Phe-NH

【技术特征摘要】
1.一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅰ所示的氨基酸序列，
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaa11-Arg-Phe-NH2(Ⅰ)；
其中，Xaa10和Xaa11同时缺失，或Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代。


2.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅱ所示的氨基酸序列；
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Arg-Phe-NH2(Ⅱ)。


3.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅲ所示的氨基酸序列；
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(Ⅲ)。


4.权利要求1所述嵌合肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成法制备多肽：先溶胀氨基树脂，抽干，洗涤并脱保护后，将第一个N-α-Fmoc保护的氨基酸与脱保护后的氨基树脂进行缩合反应，茚检确认缩合成功，再脱保护并洗涤，茚检确认脱保护完全；然后缩合第二个氨基酸，重复以上步骤，由C端向N端，直至多肽链合成完成；
(2)用切割剂将步骤(1)合成完成的多肽链进行切割，过滤，将滤液旋干，加入冰乙醚析出沉淀，萃取获得粗肽，并通过液相色谱进一步纯化，得到多肽产品。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide树脂；所述的溶胀为将氨基树脂置于二氯甲烷中，使树脂充分溶胀；二氯甲烷与氨基树脂的体积质量比为8～12mL/g。


6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的脱保护为将处理后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方泉，许彪，张梦娜，张润，李宁，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62