异源二聚化的Ig结构域制造技术

本发明专利技术提供包含异源二聚化区域HRI和HRII的蛋白质复合物，异源二聚化区域HRI和HRII各自由反向平行的β链和间隔区构成，其中HRI和HRII各自为免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的两种人恒定区的穿插融合蛋白(interspersed fusion protein)。本发明专利技术还提供了包含编码该蛋白质复合物的序列的核酸分子和包含该核酸的载体。本发明专利技术还提供了用作药物的蛋白质复合物、核酸和载体。本发明专利技术进一步提供了确定HRI的氨基酸序列和/或HRII的氨基酸序列的方法。本发明专利技术还提供了产生HRI的氨基酸链和/或HRII的氨基酸链的方法。本发明专利技术进一步提供了用于预防、治疗或诊断病症或疾病的蛋白质复合物。

Ig domain of heterodimerization

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】异源二聚化的Ig结构域本专利技术提供包含异源二聚化区域HRI和HRII的蛋白质复合物，异源二聚化区域HRI和HRII各自由反向平行的β链和间隔区构成，其中HRI和HRII各自为免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的两种人恒定区穿插的融合蛋白(interspersedfusionprotein)。本专利技术还提供了包含编码该蛋白质复合物的序列的核酸分子和包含该核酸的载体。本专利技术还提供了用作药物的蛋白质复合物、核酸和载体。本专利技术进一步提供了确定HRI的氨基酸序列和/或HRII的氨基酸序列的方法。本专利技术还提供了产生HRI的氨基酸链和/或HRII的氨基酸链的方法。本专利技术进一步提供了用于预防、治疗或诊断病症或疾病的蛋白质复合物。
技术介绍
双特异性抗体在诊断和治疗上的应用越来越引起人们的兴趣。KontermannRE和BrinkmannU(2015)DrugDiscoveryToday；20(7)：883及其引用的参考文献中提供了全面的综述。天然抗体是单特异性的，而双特异性抗体识别相同或不同抗原上的两个不同表位。双特异性抗体的应用涵盖了诊断、成像和治疗的广泛领域。最初，治疗应用主要集中于重靶向癌症治疗的效应细胞，包括不能通过正常抗体募集到肿瘤细胞的T细胞。然而，在过去的十年中，已经建立了许多基于双特异性抗体的其他治疗策略，除效应分子、细胞和遗传载体的重靶向外，还包括双重靶向策略、半衰期延长和通过血脑屏障的递送。适应症包括癌症、慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、出血性疾病和感染。具有确定特异性的双特异性抗体是人工分子，其本身在自然界中不存在。因此，它们必须通过分子或遗传手段产生。由于抗原结合位点是由轻链和重链的可变域(VL、VH)建立的，因此双特异性IgG分子的产生面临两个主要问题。第一，双特异性抗体需要两条不同的重链，第二，它还需要两条不同的轻链。因此，由于至少两个不同的可变域(Fv)区域的存在，双特异性IgG抗体表现出不对称性。在一个细胞中表达的两种抗体的重链和轻链的混杂配对理论上可以产生10种不同的组合，其中只有一种是双特异性的，其余的配对则导致无功能或单特异性的分子(Schaefer等人，2016)。指导并迫使正确结合位点即重链和轻链的正确组装是产生双特异性抗体的挑战之一。以下章节中描述的迫使重链异源二聚化的基因工程将双特异性IgG形成的问题之一作为目标。尽管异源二聚体重链仍可与两种不同的轻链组装，从而产生四种可能的组合，一种双特异性分子，一种非功能性组合和两种单特异性分子，但它将可能的组合从10种不同的分子减少为4种组合。重链配对由恒定区的最后一个结构域介导，即IgG分子中的CH3，它形成高亲和力的同源二聚体复合物。进一步的相互作用存在于负责两条重链共价连接的铰链区，其在重链组装后形成。各种策略使用空间或静电转向效应或其组合以产生相对于同源二聚化更有利于异源二聚化的互补界面。Ridgway及同事通过在一个CH3界面上将小侧链置换为较大的侧链以产生杵，并另一个CH3结构域上将大侧链置换成较小侧链以产生臼，从而生成有利于异源二聚体组装的CH3界面(Ridgway等人，1996)。测试了各种变体证明优先的异源二聚化，其中一条链上具有置换T366Y，另一条链上具有Y407T。这些最初的杵臼突变(knobs-into-holesmutation)例如用于产生针对HER2和IGF-1R的IgG。随后扩展了“杵臼”方法，通过噬菌体展示确定了其他合适的组合。然后将这些突变用于生成双特异性IgG抗体，测试另外的替换以允许形成二硫键。一种变体显示＞95％的异源二聚体形成(S354C、T366W/Y349C、T366S、L368A、Y407V)。然后将该异源二聚体重链应用于使用相同的VL结构域从单链可变片段(scFv)构建针对Mlp和HER3的双特异性抗体，从而表达共同轻链(Merchant等人，1998)。异源重链产生功能性双特异性抗体，允许通过蛋白A色谱法纯化，并保留Fc介导的效应功能，例如ADCC。该方法被采用以产生各种双特异性抗体，并且如今形成了产生双特异性IgG分子及其衍生物的通用基础，IgG分子的衍生物包括三价Ig样抗体以及双特异性Fc和CH3融合蛋白。一个例子是T细胞重靶向双特异性抗体。为了避免T细胞通过与CD3的二价结合而全身性激活，设计了仅表现出一个CD3结合位点的分子。这包括scFv-Fc(kih)(在每条Fc链上带有一个scFv)和串联scFv-Fc(kih)(BiTE-KIH)，其中串联scFv与Fc链之一融合(Xu等人，2015年)。在这项研究中，CD3结合部分分别与含杵或含臼的Fc链(KIH，KIHr)融合。令人感兴趣的是，就表达效价而言，BiTE-KIHr优于BiTE-KIH。然而，在T细胞活化和肿瘤细胞裂解方面未观察到差异。以相似的方法，Fc-KIH用于产生针对CD16和HER2的二价、双特异性scFv-Fc融合蛋白，以使NK细胞重新靶向肿瘤细胞(Xie等人，2005)。单价结合以避免受体交联和激活对于靶向细胞表面受体(例如c-MET)的抗体可能也是必不可少的。通过将Fab臂融合到Fc臼链的N端和将二硫键稳定的scFv融合到相同Fc臼链的C端，并与未融合的Fc杵共表达，从而产生了与细胞表面受体单价结合的双特异性抗体，其应用两种不同受体的双重靶向和中和作用。VH结构域与一条Fc(kih)链的C末端融合，而VL结构域单独表达或与另一条Fc(kih)链的C末端融合，产生双特异性三价IgG-Fv(mAb-Fv)融合蛋白，其中Fv片段通过域间二硫键稳定化(Metz等人，2012)。IgG-Fv融合物中Fv片段的灵活性可以通过引入蛋白水解切割位点来增加，例如对于弗林蛋白酶或MMP，在连接VL结构域和Fc链的接头中引入。切割后，产生双特异性分子，其C端Fv片段仅通过VH结构域连接至IgG。同样，生成的scFv-Fc-Fv融合蛋白对EGFR表现出两个结合位点(与Fc链的N端融合的scFv)，对LPS表现出一个结合位点(与Fc(杵)的C端融合的VH和与Fc(臼)的C端融合的VL)。双特异性IgG(kih)抗体的其他衍生物包括TriMAb。在此，将一个或两个二硫键稳定的scFv与一条或两条Fc(kih)链融合，分别得到三特异性、三价或四价抗体。对于靶向EGFR、IGF-1R和cMet，或EGFR、IGF-1R和HER3的TriMAb，这已显示出来。在这种方法中，Fab片段由具有二硫键稳定的Fv结构域的单链Fab片段组成。近来，杵臼策略被扩展到其他IgG同型以产生IgG4异源二聚体，其本身缺乏Fc介导的效应功能，例如产生针对IL-4和IL-13的双特异性抗体。使用基于结构和序列的方法探索跨CH3二聚体的界面上配对变体组合的能量，产生了HA-TF变体(S364H、F405A/Y349T、394F)，该变体在开发用于共靶向HER2(二价结合)和CD3(单价结合)的双特异性mAb-Fv(IgG-Fv)分子的情况下显示出约83％的异源二聚体形成。使用此CH3异源二聚体的其他例子包括单价和二价scFv-Fc融合蛋白。另一种合理的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质复合物，其包含至少两个氨基酸链I和氨基酸链II，它们通过包含在氨基酸链I中的异源二聚化区域I(HRI)和包含在氨基酸链II中的异源二聚化区域II(HRII)彼此非共价结合，其中：/n(a)HRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链AI、BI、CI、DI、EI、FI和GI，六个间隔区bI、cI、dI、eI、fI和gI，N端区域aI和C端区域hI：/naI-AI-bI-BI-cI-CI-dI-DI-eI-EI-fI-FI-gI-GI-hI/n其中HRI是穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第二人恒定区的氨基酸(第二CRI，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第一人恒定区(第一CRI，受体)的融合蛋白，/n其中第一CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A1、B1、C1、D1、E1、F1和G1，六个间隔区b1、c1、d1、e1、f1和g1，N端区域a1和C端区域h1：/na1-A1-b1-B1-c1-C1-d1-D1-e1-E1-f1-F1-g1-G1-h1/n其中第二CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A2、B2、C2、D2、E2、F2和G2，六个间隔区b2、c2、d2、e2、f2和g2，N端区域a2和C端区域h2：/na2-A2-b2-B2-c2-C2-d2-D2-e2-E2-f2-F2-g2-G2-h2/n其中HRI具有第一CRI的氨基酸序列，并且其中第一CRI的至少以下氨基酸被第二CRI的以下氨基酸置换：/n(i)a1的至少一个氨基酸被a2的至少1个氨基酸置换(置换1)；/n(ii)c1的至少一个氨基酸被c2的至少1个氨基酸置换(置换2)；和/n(iii)g1的至少一个氨基酸被g2的至少1个氨基酸置换(置换3)；/n且/n(b)HRII包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链AII、BII、CII、DII、EII、FII和GII，六个间隔区bII、cII、dII、eII、fII和gII，N端区域aII和C端区域hII：/naII-AII-bII-BII-cII-CII-dII-DII-eII-EII-fII-FII-gII-GII-hII/n其中HRII是穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第四人恒定区的氨基酸(第四CRI，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第三人恒定区(第三CRI，受体)的融合蛋白，并且其中/n第三CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链A3、B3、C3、D3、E3、F3和G3，六个间隔区b3、c3、d3、e3、f3和g3，N端区域a3和C端区域h3：/na3-A3-b3-B3-c3-C3-d3-D3-e3-E3-f3-F3-g3-G3-h3/n其中第四CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A4、B4、C4、D4、E4、F4和G4，六个间隔区b4、c4、d4、e4、f4和g4，N端区域a4和C端区域h4：/na4-A4-b4-B4-c4-C4-d4-D4-e4-E4-f4-F4-g4-G4-h4/n其中HRII具有第三CRI的氨基酸序列，并且其中第三CRI的至少以下氨基酸被第四CRI的以下氨基酸置换：/n(i)a3的至少一个氨基酸被a4的至少1个氨基酸置换(置换4)；/n(ii)c3的至少一个氨基酸被c4的至少1个氨基酸置换(置换5)；和/n(iii)g3的至少一个氨基酸被g4的至少1个氨基酸置换(置换6)；/n其中第一CRI和第三CRI彼此不同，并且在生理条件下彼此特异性地结合。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170601 EP 17174087.11.一种蛋白质复合物，其包含至少两个氨基酸链I和氨基酸链II，它们通过包含在氨基酸链I中的异源二聚化区域I(HRI)和包含在氨基酸链II中的异源二聚化区域II(HRII)彼此非共价结合，其中：
(a)HRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链AI、BI、CI、DI、EI、FI和GI，六个间隔区bI、cI、dI、eI、fI和gI，N端区域aI和C端区域hI：
aI-AI-bI-BI-cI-CI-dI-DI-eI-EI-fI-FI-gI-GI-hI
其中HRI是穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第二人恒定区的氨基酸(第二CRI，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第一人恒定区(第一CRI，受体)的融合蛋白，
其中第一CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A1、B1、C1、D1、E1、F1和G1，六个间隔区b1、c1、d1、e1、f1和g1，N端区域a1和C端区域h1：
a1-A1-b1-B1-c1-C1-d1-D1-e1-E1-f1-F1-g1-G1-h1
其中第二CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A2、B2、C2、D2、E2、F2和G2，六个间隔区b2、c2、d2、e2、f2和g2，N端区域a2和C端区域h2：
a2-A2-b2-B2-c2-C2-d2-D2-e2-E2-f2-F2-g2-G2-h2
其中HRI具有第一CRI的氨基酸序列，并且其中第一CRI的至少以下氨基酸被第二CRI的以下氨基酸置换：
(i)a1的至少一个氨基酸被a2的至少1个氨基酸置换(置换1)；
(ii)c1的至少一个氨基酸被c2的至少1个氨基酸置换(置换2)；和
(iii)g1的至少一个氨基酸被g2的至少1个氨基酸置换(置换3)；
且
(b)HRII包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链AII、BII、CII、DII、EII、FII和GII，六个间隔区bII、cII、dII、eII、fII和gII，N端区域aII和C端区域hII：
aII-AII-bII-BII-cII-CII-dII-DII-eII-EII-fII-FII-gII-GII-hII
其中HRII是穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第四人恒定区的氨基酸(第四CRI，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第三人恒定区(第三CRI，受体)的融合蛋白，并且其中
第三CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反向平行的β链A3、B3、C3、D3、E3、F3和G3，六个间隔区b3、c3、d3、e3、f3和g3，N端区域a3和C端区域h3：
a3-A3-b3-B3-c3-C3-d3-D3-e3-E3-f3-F3-g3-G3-h3
其中第四CRI包含按以下顺序从N端到C端布置的七个反平行的β链A4、B4、C4、D4、E4、F4和G4，六个间隔区b4、c4、d4、e4、f4和g4，N端区域a4和C端区域h4：
a4-A4-b4-B4-c4-C4-d4-D4-e4-E4-f4-F4-g4-G4-h4
其中HRII具有第三CRI的氨基酸序列，并且其中第三CRI的至少以下氨基酸被第四CRI的以下氨基酸置换：
(i)a3的至少一个氨基酸被a4的至少1个氨基酸置换(置换4)；
(ii)c3的至少一个氨基酸被c4的至少1个氨基酸置换(置换5)；和
(iii)g3的至少一个氨基酸被g4的至少1个氨基酸置换(置换6)；
其中第一CRI和第三CRI彼此不同，并且在生理条件下彼此特异性地结合。


2.根据权利要求1所述的蛋白质复合物，其中免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白选自IgG1、Igκ、T细胞受体(TCR)α、TCRβ、初生Fc受体(FcRn)、β2微球蛋白、Igλ、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、人白细胞抗原(HLA)A或人白细胞抗原(HLA)B、和HLA-D。


3.根据权利要求1或2所述的蛋白质复合物，其中第一CRI和第三CRI独立地选自IgG1的重链恒定区1(CH1)，其优选具有根据SEQIDNO：1的氨基酸序列；Igκ的恒定区，其优选具有根据SEQIDNO：18的氨基酸序列；T细胞受体(TCR)α的恒定区，其优选具有根据SEQIDNO：10的氨基酸序列；TCRβ的恒定区，其优选具有根据SEQIDNO：11的氨基酸序列；初生Fc受体(FcRn)α3，其优选具有根据SEQIDNO：12的氨基酸序列；β2微球蛋白，其优选具有根据SEQIDNO：13的氨基酸序列；Igλ恒定区，其优选具有根据SEQIDNO：19的氨基酸序列；IgG2，其优选具有根据SEQIDNO：2的氨基酸序列；IgG3，其优选具有根据SEQIDNO：3的氨基酸序列；IgG4，其优选具有根据SEQIDNO：4的氨基酸序列；IgA1，其优选具有根据SEQIDNO：5的氨基酸序列；IgA2，其优选具有根据SEQIDNO：6的氨基酸序列；IgD，其优选具有根据SEQIDNO：7的氨基酸序列；IgE，其优选具有根据SEQIDNO：8的氨基酸序列；IgM，其优选具有根据SEQIDNO：9的氨基酸序列；人白细胞抗原(HLA)A，其优选具有根据SEQIDNO：14的氨基酸序列；或HLA-Bα3，其优选具有根据SEQIDNO：15的氨基酸序列；HLA-Dα2，其优选具有根据SEQIDNO：16的氨基酸序列；和HLA-Dβ2，其优选具有根据SEQIDNO：17的氨基酸序列，
其中，优选选择第一CRI和第三CRI的以下组合：
(i)第一CRI：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的CH1，和第三CRI：Igκ恒定区和Igλ恒定区；
(ii)第一CRI：TCRα的恒定区，和第三CRI：TCRβ的恒定区；
(iii)第一CRI：FcRnα3、HLA-Aα3、或HLA-Bα3，和第三CRI：β2微球蛋白；和
(iv)第一CRI：HLA-Dα2，和第三CRI：HLA-Dβ2。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质复合物，其中
(i)第二CRI和第四CRI相同且选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2的CH3；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的CH1；或IgD；IgE或IgM的CH4；以及Igκ恒定区或Igλ恒定区，或
(ii)第二CRI和第四CRI独立地选自IgG1的CH1；Igκ恒定区或Igλ恒定区；IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的CH1；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的CH3；以及IgE或IgM的CH4。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质复合物，
(i)其中在置换1和/或置换4中，第一CRI或第三CRI的β链A的N端所有氨基酸(Ig样恒定区共有序列(IgLCRC，在图4中描绘)的位置1至12)分别被置换为第二CRI或第四CRI的β折叠A的N端所有氨基酸(IgLCRC的位置1至12)；
(ii)其中在置换2和/或5中，第一CRI或第三CRI的IgLCRC的位置41至45、41至46、41至47、41至48、41至49、41至50、41至51、42至45、42至46、42至47、42至48、42至49、42至50、42至51、43至45、43至46、43至47、43至48、43至49、43至50、43至51、44至45、44至46、44至47、44至48、44至49、44至50、44至51、45至45、45至46、45至47、45至48、45至49、45至50、或45至51处的氨基酸分别被置换为第二CRI或第四CRI的IgLCRC的位置41至45、41至46、41至47、41至48、41至49、41至50、41至51、42至45、42至46、42至47、42至48、42至49、42至50、42至5...

【专利技术属性】
技术研发人员：法比安·里克特，奥利弗·塞弗特，罗兰·康特曼，
申请(专利权)人：斯图加特大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE