包含修饰的EHD2结构域的结合模块制造技术

本发明专利技术涉及包含两个多肽链的结合分子，其中肽链包含仅允许异二聚化的修饰的EHD2结构域，从而防止同二聚体，编码此类结合分子的核酸以及此类结合分子或编码此类结合分子的核酸在治疗中的用途。酸在治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含修饰的EHD2结构域的结合模块
[0001]本专利技术涉及包含两个多肽链的结合分子，其中多肽链包含仅允许异二聚化的修饰的EHD2结构域，从而防止同二聚体。本专利技术还涉及编码此类结合分子的核酸以及此类结合分子或编码此类结合分子的核酸在治疗中的用途。

技术介绍

[0002]具有至少两种不同特异性的抗体
‑
所谓的双特异性抗体已经引起了对于广泛应用的越来越多的关注，包括诊断、成像、预防和治疗。除了重新靶向效应分子、细胞和遗传载体之外，还利用了双重靶向和预靶向策略、蛋白质自然功能的模拟、半衰期延长以及通过血脑屏障等生物屏障的传递(Labrijn等人，2019，Nat.Rev.Drug.Discov.18：585
‑
608)。双特异性抗体已被评估为各种适应症，包括癌症、慢性炎症性疾病、自身免疫、神经退行性疾病、出血性病症和感染的潜在治疗方法。
[0003]可根据形式和组成分类双特异性抗体(Brinkmann&Kontermann，2017，MAbs 9：182
‑
212)。主要的区别是是否存在Fc区。不具有Fc的双特异性抗体将会缺少Fc介导的效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体固定和FcRn介导的再循环，这是大多数γ免疫球蛋白半衰期长的原因。包含Fc区的双特异性抗体可进一步分为表现出类似于IgG分子结构的抗体和包含额外结合位点的抗体，即具有附加或修饰的Ig样结构的抗体。
[0004]然而，由于抗原结合位点是由轻链和重链(VL、VH)的可变结构域构建的，因此二价双特异性的IgG或Ig样分子的生成是复杂的。在一个细胞中表达的两种抗体的重链和轻链的混杂配对理论上可以产生16种不同的组合(10种不同的分子)，其中只有一种是双特异性，其余配对产生非功能性或单特异性分子。指导和强制正确组装正确的结合位点，即正确特异性的重链和轻链是生成双特异性抗体的挑战之一。在过去二十年中，为解决这些问题开发和确立了各种策略。
[0005]产生两种抗体的细胞系的融合，例如生成杂交的杂交瘤(四源杂交瘤)允许两种不同抗体的重链和轻链的组合。由此产生的双特异性抗体因此包含第一抗体的重链和轻链和第二抗体的重链和轻链。重链恒定区和轻链恒定区可以是相同的同种型，也可以是不同的同种型。它们甚至可以是不同的物种，即用于生成三功能抗体(triomab)的策略。在这种形式中，小鼠杂交瘤与大鼠杂交瘤融合，从而产生双特异性不对称的杂交IgG分子。描述了轻链和其相应重链的优先配对。重要地是，由于减少的结合，异二聚体的Fc部分允许通过蛋白A层析的分级纯化，并且柱的洗脱已经在pH约为5.8时发生。此外，产生两种不同重链和轻链的细胞系可以通过遗传方式生成。这允许使用具有确定组成的重链和轻链，例如某些人同种型，以及突变序列的实施，但重链和轻链的随机配对仍然是这些方法的主要障碍之一。
[0006]基因工程迫使重链异二聚化，解决了双特异性IgG形成的问题之一，如引入到C
H
3结构域中的knobs
‑
into
‑
holes突变和静电引导突变(Krah等人，2017，N.Biotechnol.39：167
‑
173)。然而，异二聚体的重链仍然可以与两个不同的轻链组装，导致了四种可能的组合：一种双特异性分子、一种非功能性组合和两种单特异性分子。因此，已经开发了方法以
允许同源的重链和轻链与Fc修饰的重链的正确配对。一种方法是在IgG分子的两个重链中使用共同轻链来形成功能性结合位点(Merchant等人，1998，Nat.Biotechnol.16：677
‑
681)。然而，这需要利用相同的VL结构域来识别和分离抗原结合位点。
[0007]或者，已经引入到一个结合位点的轻链和重链的Fd片段(V
H
‑
C
H
1片段)中的突变和修饰迫使重链和轻链正确配对(Krah等人，2017，N.Biotechnol.39：167
‑
173)。这些策略包括修饰一个重链和一个轻链的C
H
1和C
L
结构域，在某些情况下还包括V
H
和V
L
区域。例如CrossMab技术，其中C
H
1和C
L
结构域在一条重链和一条轻链之间交换(Klein等人，2012，MAbs 4：653
‑
663)，引入C
H
1和C
L
结构域中的正交Fab突变(Lewis等人，2014，Nat.Biotechnol.32：191
‑
198)，或者添加V
H
和V
L
结构域(Golay等人，2016，J.Immunol.196：199
‑
211；Froning等人，2017，Protein Sci.26：2021
‑
2038；等人，2017，Protein Eng.Des.Sel.，2017，30：685
‑
696)，以及Duetmab技术，其中C
H
1和C
L
之间的天然二硫键被除去，并被新的人工引入的二硫键置换(Mazor等人，2015，MAbs 7：461
‑
469)。
[0008]另一种方法是将一个重链和一个轻链的C
H
1和C
L
结构域置换为其他蛋白的结构相关结构域，例如来自T细胞受体(TCR)的C
‑
α和C
‑
β结构域(Wu等人，2015，MAbs 7：470
‑
482)。或者，C
H
1和C
L
结构域被来自IgE的突变重链结构域2置换，其自然形成同二聚体。引入这种所谓的EFab模块的突变允许形成减少同二聚化并且允许异二聚体Fab样分子的形成的knob
‑
into
‑
hole样结构(Cooke等人，2018，MAbs 10：1248
‑
1259)。然而，这些knob
‑
into
‑
hole突变的通常的问题是形成含有hole突变的结构域的同二聚体相互作用的可能性。在EFab形式中，这些hole突变存在于轻链中，因此具有形成轻链同二聚体的风险(Kuglstatter等人，2017，ProteinEng.Des.Sel.30：649
‑
656)。此外，最终是由于这些突变域之间的界面中的无序区域，与野生型Fab片段和野生型EHD2Fab分子相比，观察到EFab的热稳定性降低和对蛋白水解裂解的敏感性增加(Cooke等人，2018，MAbs 10：1248
‑
1259)。
[0009]最近提出了生成异二聚化E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种结合分子，其包含：包含第一结合结构域(BD1)和第一修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
1)的第一多肽链，和包含第二结合结构域(BD2)和第二修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
2)的第二多肽链，其中EHD2
‑
1和EHD2
‑
2的氨基酸序列彼此不同，并且各自选自(i)与SEQ ID NO：1具有至少70％氨基酸同一性且在14位不具有Cys的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：1具有至少70％氨基酸同一性且在102位不具有Cys的氨基酸序列，其中BD1和BD2一起形成抗原结合位点，并且其中EHD2
‑
1和EHD2
‑
2彼此共价结合。2.根据权利要求1所述的结合分子，其中BD1和BD2彼此不同并且各自选自V
H
和V
L
或选自TCRα
‑
链的可变区和TCRβ
‑
链的可变区。3.根据权利要求1至2中任一项所述的结合分子，其还包含第一Fc链。4.根据权利要求1至3中任一项所述的结合分子，其还包含第三结合结构域(BD3)和第四结合结构域(BD4)，其中BD3和BD4一起形成抗原结合位点，优选地其中BD3和BD4彼此不同，且各自选自V
H
和V
L
或选自TCRα
‑
链可变区和TCRβ
‑
链可变区。5.根据权利要求4或6所述的结合分子，其中结合分子还包含第三多肽链，优选地其中结合分子还包含第三多肽链和第四多肽链，更优选地还包含第二Fc链。6.根据权利要求5所述的结合分子，其中包含BD3的第三多肽链还包含以下中的一个：(i)C
H
1结构域，(ii)C
L
结构域，(iii)第一修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
1)，和(iv)第二修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
2)，且其中包含BD4的第四多肽链在(i)的情况下还包含C
L
结构域，在(ii)的情况下还包含C
H
1结构域，在(iii)的情况下还包含第二修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
2)，和在(iv)的情况下还包含第一修饰的EHD2结构域(EHD2
‑
1)，其中EHD2
‑
1和EHD2
‑
2的氨基酸序列彼此不同，并且各自选自与SEQ ID NO：1具有至少70％氨基酸同一性且在14位不具有Cys的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少70％氨基酸同一性且在102位不具有Cys的氨基酸序列。7.根据权利要求4至6中任一项所述的结合分子，其还包含第五结合结构域(BD5)和第六结合结构域(BD6)，其中BD5和BD6一起形成抗原结合位点，优选地其中BD5和BD6彼此不同，且各自选自V
H
和V
L
或选自TCRα
‑
链可变区和TCRβ
‑
链可变区，更优选地其中结合分子还包含连接至BD5的(i)C
H
1结构域，(ii)C
L
结构域，(iii)第一修饰的EHD2结构域(EHD2
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗兰，
申请(专利权)人：斯图加特大学，
类型：发明
国别省市：