无环单萜的酶促单环化制造技术

具有角鲨烯

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无环单萜的酶促单环化


本专利技术涉及具有环化酶活性的新型酶突变体，并涉及使用该新型酶突变体将无环单萜单环化的方法。本专利技术的其它实施方案涉及编码新的酶突变体的核酸序列、包含这种核酸序列的表达盒以及重组载体，所述重组载体在调控元件的控制下包含至少一种根据本专利技术的核酸序列或至少一种根据本专利技术的表达盒。此外，本专利技术涉及重组微生物，其包含至少一种根据本专利技术的核酸序列或至少一种根据本专利技术的表达盒或至少一种根据本专利技术的重组载体。

技术介绍

萜烯与特定环化酶的环化本身是已知的。例如，在自然界发生的过程中，用角鲨烯
‑
何帕烯(hopene)环化酶将角鲨烯环化成五环化合物何帕烯。脱辅基类胡萝卜素(Apocarotenoid)是天然存在的类异戊二烯结构，来源于几种C40
‑
类胡萝卜素的氧化裂解。那些主要由少于15个碳原子组成的较短类似物通常用于个人护理产品或食品调味剂的香料和芳香剂工业中，因此具有很高的经济价值。诸如大马酮5
‑
7、大马酮8或紫罗兰型气味分子(如紫罗兰酮1
‑
3和二氢紫罗兰酮4)的玫瑰酮由于其极低的气味阈值而在该领域具有突出的地位。这种性质以及气味本身与分子的整体结构密切相关，因此人们非常希望通过化学合成轻松获得。紫罗兰酮1
‑
3作为已知时间最长且研究最多的脱辅基类胡萝卜素，或作为异构体的混合物从植物中提取，或通过较高分子类胡萝卜素的氧化裂解衍生，抑或通过酸催化环化其线性前体来合成。因此，使用磷酸、硫酸或诸如三氟硼酸的路易斯酸，酸的选择决定了所得产物α
‑
1、β
‑
2或γ
‑
紫罗兰酮3。它们的嗅觉特性都不同，其中(S)
‑
γ
‑
衍生物具有最强烈和令人愉快的气味。为了获得(S)
‑
γ
‑
紫罗兰酮3，立体选择性环化将是优选的，但在经典有机化学中仍然是一个挑战，因此通常使用多步合成和脂肪酶催化分解的方法。相应的二氢紫罗兰酮(4)在性质上与紫罗兰酮(1
‑
3)相当。随后，这里最突出的衍生物也是γ衍生物9。它是龙涎香的主要成分龙涎香醇(ambrein)的光氧化降解产物，由于其在市场上的高价值，也被称为“漂浮的黄金”。
化合物(+)
‑
9可作为前体分三步化学合成10、11、12，并在一步环化中富集13。为了获得(+)
‑
9，前体紫罗兰酮必须在雷尼镍(Raney
‑
Nickel)存在下用氢气化学还原，或者用高压汞灯照射。从商业上可获得的香叶基丙酮(16t)的直接环化方法受到必然需要的环氧衍生物、保护基团的困扰，或者最终成为双环或多环产物。因此，(+)
‑
9在市场上基本上是买不到的，因为合成成本高且繁琐。一般来说，文献中已经描述了产生类胡萝卜素的两种方法：一方面是基于酸性环化分为多相和均相催化的化学方法，另一方面是基于类胡萝卜素裂解酶的一些生物技术方法。化学方法文献中已知的二氢紫罗兰酮(4)的最早制备方法是还原相应的前体紫罗兰酮。Francke等人描述了将(+)
‑
1氢化成ee值为18％的还原化合物(+)
‑
α
‑
二氢紫罗兰酮(Francke,W.,Schulz,S.,Sinnwell,V.,W.A.,&Roisin,Y,Epoxytetrahydroedulan,a new terpenoid from the hairpencils of Euploea(Lep.:Danainae)butterflies.Liebigs Annalen der Chemie 1989.12,1195
‑
1201(1989))。在2000年，Fuganti等人(Fuganti,C.,Serra,S.&Zenoni,A.Synthesis and olfactory evaluation of(+)
‑
and(
‑
)
‑
γ
‑
ionone.Helv.Chim.Acta 83,2761
–
2768(2000))首先评估了(+/
–
)
‑
γ
‑
紫罗兰酮3和(+/
–
)
‑
γ
‑
二氢紫罗兰酮9的嗅觉特性，通过四个步骤合成外消旋的3，进行结晶和脂肪酶催化分解，最后通过钯催化还原对映体纯的紫罗兰酮，得到对映体纯的(+)
‑
9，总产率为6％。Tsangarakis等人(Tsangarakis,C.&Stratakis,M.Biomimetic cyclization of small terpenoids promoted by zeolite NaY:Tandem formation ofα
‑
ambrinol from geranyl acetone.Adv.Synth.Catal.347,1280
–
1284(2005))研究了NaY促进的小萜类香叶醇、乙酸香叶酯、乙酸法呢酯和香叶丙酮16t的环化。该催化剂完全没有选择性，并且没有给出α
‑
二氢紫罗兰酮的产率，因为该化合物在反应混合物中的存在量不超过可忽略的量。
在2008年，Justicia(Justicia,J.等人Titanium
‑
catalyzed enantioselective synthesis ofα
‑
ambrinol.Adv.Synth.Catal.350,571
–
576(2008))和合作者提出了从香叶基丙酮16t开始的(
–
)
‑
α
‑
龙涎香八氢萘醇(ambrinol)13的第一个对映选择性合成。整个序列经过8个化学步骤得到18％的收率。Serra,S.,Fuganti,C.&Brenna,E.Two easy photochemical methods for the conversion of commercial ionone alpha into regioisomerically enrichedγ
‑
ionone andγ
‑
dihydroionone.Flavour Fragr.J.22,505
–
511(2007)描述了另外的合成区域异构体富集的γ
‑
二氢紫罗兰酮9的方法。作者使用了商品α
‑
紫罗兰酮1，将该底物还原和乙酰化，最后辐照二氢
‑
α
‑
紫罗兰醇乙酸酯得到富集的9。该方法需要6
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9个步骤，并且缺乏对映选择性。在Serra,S.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.具有角鲨烯
‑
何帕烯环化酶活性的酶突变体，其选自野生型酶的突变体，所述野生型酶包含选自SEQ
‑
ID No.1至3的氨基酸序列或由其衍生的、序列同一性程度在SEQ
‑
ID No.1至3的60％至99.9％的范围内的氨基酸序列，其中所述突变体至少催化通式(I)所示底物的一步单环化，转化成式(II)所示的单环化合物：其中取代基R1和R2中的至少一个选自＝O、
‑
OH、巯基、氨基、酯基、卤素、硝基或腈基，并且其中取代基R1和R2中的至少一个选自氢、烷基或亚烷基。2.根据权利要求1所述的酶突变体，其包含a)SEQ
‑
ID No.1的G600位的突变，或b)选自氨基酸序列SEQ
‑
ID No.2
‑
3的氨基酸序列中的突变，其中突变的位置对应于SEQ
‑
ID No.1的G600位。3.根据前述权利要求中任一项所述的酶突变体，其中与SEQ
‑
ID No.1或SEQ
‑
ID No.2
‑
3相比，多达10％的氨基酸基团通过缺失、插入、取代、添加或其组合而被修饰。4.根据前述权利要求中任一项所述的酶突变体，其中在氨基酸序列SEQ
‑
IDNo.1的G600位或SEQ
‑
ID No.2至SEQ
‑
ID No.3之一中对应于SEQ
‑
ID No.1的G600位的位置的突变是选自G600A、G600S、G600C、G600T、G600N、G600D、G600Q和G600E的取代。5.根据前述权利要求中任一项所述的酶突变体，其另外包含在SEQ
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ID No.1的Y420或L607位之一中的至少一个突变，或在选自氨基酸序列SEQ
‑
ID No.2至SEQ
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ID No.3的氨基酸序列中分别对应于SEQ
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ID No.1的Y420或L607位的至少一个突变。6.根据前述权利要求中任一项所述的酶突变体，其包含在SEQ
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：伯恩哈德，
申请(专利权)人：斯图加特大学，
类型：发明
国别省市：