本发明专利技术公开了一种细胞色素P450环氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，通过在大肠杆菌中表达所述环氧酶CytP，利用全细胞转化法，将降冰片烯转化为环氧降冰片烷。并从反应的pH、温度、相比和诱导时间等因素对CytP酶的两相催化体系进行优化，克服了之前P450单加氧酶环氧化活性低且催化特异性差的局限，可使得环氧降冰片烷产量达到36.81g/L，催化特性达到99％，环氧化反应摩尔产率达31.46％。从而大大降低了之前的底物成本和环境污染等问题，为环氧降冰片烷的工业化生产和绿色生产奠定了基础。冰片烷的工业化生产和绿色生产奠定了基础。冰片烷的工业化生产和绿色生产奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种细胞色素P450环氧酶及其应用
[0001]本专利技术涉及一种细胞色素P450环氧酶及其应用，属于生物工程
技术介绍
[0002]环氧降冰片烷，又名3-环氧丙基[3,2,1,0
2,4
]辛烷，属于降茨烷的衍生物之一。作为一个饱和的桥环化合物，其化学式为C7H
10
O，熔点为126℃。它是由环己烷的碳骨架在1，4位桥连一个亚甲基，同时2，3位与一个氧原子构成环氧结构形成的。
[0003]目前，环氧降冰片烷的主要生产方法为化学合成法，主要为过氧化氢法，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备环氧降冰片烷具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备环氧降冰片烷。
[0004]目前，微生物法生产环氧降冰片烷涉及到一个关键的酶细胞色素P450环氧酶(CytP，Cytochrome P450 epoxidase)，它具有广泛的底物杂泛性，可以催化降冰片烯，使其C＝C双键环氧化，形成环氧降冰片烷。而微生物法制备环氧降冰片烷主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境有利、反应温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备环氧降冰片烷受到以下限制：(1)底物降冰片烯不溶于水，反应体系中有机溶剂的加入对CytP存在抑制作用；(2)过氧化氢作为反应物之一为产物提供氧原子，进一步对酶活造成不可逆的损失；(3)伴随着催化反应的进行，CytP强大的催化能力和底物杂泛性使得副产物生成，导致催化特异性降低，这极大程度限制了环氧降冰片烷的产率及后期分离纯化，是目前研究的重点问题。此外，如ShengxiJin，Thomas M,Makris等人所研究的P450酶的烯烃环氧化反应机理报道，P450酶作为加氧酶，当底物存在C＝C双键时，更偏向于催化羟基化反应，而环氧化反应一直是不被期望的转化率低的副反应(公开于《Epoxidation of Olefins by Hydroperoxo-Ferric Cytochrome P450》，2003年)。为实现环氧化反应，P450酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造，而专一性催化环氧化反应更是一项挑战。
技术实现思路
[0005]在目前的研究中，P450环氧酶中的大部分酶都不能够对底物实现单一性的催化环氧化，导致催化效率低、产量极低。
[0006]近年来，细胞色素P450酶催化路径的深入研究为催化单一环氧化反应提供了新思路
[0007]——CouplingⅡ分流途径。区别于P450酶经典的羟基化单加氧途径，CouplingⅡ分流途径既不需要额外的氧化还原蛋白伴侣也不需要NAD(P)H辅因子，过氧化氢作为该途径中唯一的氧来源，最终产生单一的环氧化产物。CouplingⅡ分流途径为P450酶转化法制备环氧降冰片烷打通了催化特异性低下的壁垒。
[0008]但是专利技术人在前期的研究中发现，在庞大的P450酶系中，并不是所有的酶都能催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。
[0009]因此，本专利技术提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，并利用该环氧酶催化降冰片烯制备环氧降冰片烷。利用该环氧酶CytP构建重组菌，进行全细胞法转化生产环氧降冰片烷，具有低环境损害、高催化特异性、减少了转化中的副产物等优点，极大提高了工业化的生产效率。
[0010]本专利技术提供的细胞色素P450环氧酶CytP，其相应的亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术提供了一种合成环氧降冰片烷的方法，其特征在于，利用表达来源于Pseudomonas putida KT2440的环氧酶CytP的菌株以降冰片烯为底物，生产环氧降冰片烷。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，以pET28a为表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)中表达所述CytP酶。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中含有有机相和水相，所述有机相和水相的体积比为(2-6:1)。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述有机相为乙酸乙酯，所述水相为磷酸缓冲液。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，反应pH为8.0-8.5。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，反应温度为30-37℃。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，将菌株经过IPTG诱导12-13h或16-17h后，收集细胞，将细胞加入反应体系中反应。
[0020]本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环氧酶CytP在制备环氧降冰片烷中的应用。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，以所述环氧酶CytP，或以表达所述环氧酶CytP的基因工程菌为催化剂，催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株。
[0024]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，用于催化生产环氧降冰片烷。所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该环氧酶不仅大大提高了P450酶的环氧化活性，同时对底物具有很高的催化特异性，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本。本专利技术提供的环氧酶以降冰片烯为底物时环氧降冰片烷的产量可达36.81g/L，摩尔产率可达31.46％，羟基化副产物产量<0.01g/L，摩尔产率<0.0084％，加快了酶转化法生产环氧降冰片烷的工业化进程。
附图说明
[0025]图1为本专利技术细胞色素P450环氧酶诱导表达的SDS-PAGE图；泳道1～3分别是25℃下0.2mM IPTG浓度诱导表达后全细胞、上清液和沉淀中所目的蛋白条带大小。
[0026]图2为酶活性验证图，对转化体系内各组分进行缺失对照，对比环氧化产物和羟基化副产物的生成情况图。
[0027]图3为转化缓冲液pH和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0028]图4为转化温度和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0029]图5为两相比例和环氧降冰片烷生产量的关系图。
[0030]图6为重组菌诱导时间和环氧降冰片烷生产量的关系图。
具体实施方式
[0031]实施例1：CytP酶的表达与纯化
[0032]基因工程菌的构建及蛋白的表达：
[0033]以恶臭假单胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种合成环氧降冰片烷的方法，其特征在于，利用表达来源于Pseudomonas putida的环氧酶的菌株以降冰片烯为底物，生产环氧降冰片烷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以pET28a为表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)中表达所述环氧酶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，燕宇，宋伟，陈修来，刘佳，高聪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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