环氧角鲨烯的制备方法及工程菌技术

本发明专利技术涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，该制备方法将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML

【技术实现步骤摘要】
环氧角鲨烯的制备方法及工程菌


[0001]本专利技术涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，属于生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]三萜类化合物是一类广泛应用于医药、保健和化妆品等行业的天然产物，具有巨大的商业价值。生物合成三萜类化合物依赖于环氧角鲨烯的高效合成。角鲨烯环氧化酶是整个合成途径中的关键酶，它能够催化NAD(P)H依赖的环氧化反应，将角鲨烯转变为环氧角鲨烯。
[0003]角鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase)催化形成2,3-环氧角鲨烯是整个通路中的第一个重要限速环节。角鲨烯环化酶是一种非细胞色素P450酶系 (cytochrome P450，CYP450)的环氧化烯烃酶。它不含有血红素，活性位点不需要结合金属离子；然而，该酶促反应处需要分子氧[O]外，还需要辅因子FAD、 NAD(P)H的参与。催化过程如同某些细胞色素P450酶系反应一样，还原型黄素蛋白接受分子氧[O]形成亲电体，再将分子氧[O]传递给角鲨烯产生。氧化型黄素蛋白则需要如同细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)作用下以NAD(P)H为电子供体偶联还原。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种环氧角鲨烯的制备方法，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9
TC
，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSE
TC
基因中的任一种；所述erg9
TC
的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ ID NO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSE
TC
基因的序列为SEQ IDNO.4。
[0006]进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
[0007]S1、构建含有所述erg9
TC
的pSMLSQ载体；
[0008]S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSE
TC
的pTMcSE载体、pTFtSE 载体和pTRnSE
TC
载体。
[0009]进一步地，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9
TC
克隆至pSMvL2 载体中构建而成。
[0010]进一步地，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE
TC
载体分别由所述McSE、FtSE和RnSE
TC
克隆至pTrc99A载体中构建而成。
[0011]进一步地，所述制备方法还包括：
[0012]S3、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE
TC
载体分别与pSMLSQ 载体共转化大
肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶的ML-SQE4、 ML-SQE3和ML-SQE2工程菌；
[0013]S4、培养所述ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌得到环氧角鲨烯。
[0014]进一步地，还包括在所述大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶，所述醌氧化还原酶的编码基因为WrbA基因，所述WrbA基因的序列为SEQ ID NO.5。
[0015]进一步地，所述制备方法还包括：
[0016]S3、将所述WrbA基因克隆至所述pSMLSQ载体构建pSMLSQWrbA载体；
[0017]S4、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE
TC
载体分别与 pSMLSQWrbA载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶和醌氧化还原酶的ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌；
[0018]S5、培养所述ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌得到环氧角鲨烯。
[0019]本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌。
[0020]本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本申请的环氧角鲨烯的制备方法及工程菌将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。
[0022]同时，本申请还通过在大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶WrbA完成角鲨烯的加氧作用，进一步提高了环氧角鲨烯的产量。
[0023]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0024]图1A为本专利技术一实施例所示的大肠杆菌中环氧角鲨烯的表达构建示意图；
[0025]图1B为本专利技术一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱分析图；
[0026]图2A为本专利技术一实施例中不同种类的角鲨烯环氧化酶的表达构建示意图；
[0027]图2B和图2C为本专利技术一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱-质谱分析图；
[0028]图3A为本专利技术一实施例所示的强Trc启动子调控CPRL表达构建示意图；
[0029]图3B为本专利技术一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图；
[0030]图3C为本专利技术一实施例所示的重度lac启动子调控CPRL表达构建示意图；
[0031]图3D为本专利技术一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图。
具体实施方式
[0032]下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0033]一、载体构建
[0034]市面上购买或自行制备：大肠杆菌中完整MVA途径表达载体pSNA；由 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9
TC
，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSE
TC
基因中的任一种；所述erg9
TC
的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ ID NO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSE
TC
基因的序列为SEQ ID NO.4。2.如权利要求1所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、构建含有所述erg9
TC
的pSMLSQ载体；S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSE
TC
的pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE
TC
载体。3.如权利要求2所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9
TC
克隆至pSMvL2载体中构建而成。4.如权利要求3所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSE
TC
载体分别由所述McSE、FtSE和RnSE
TC
克隆至pTrc99A载体中构建而成。5.如权利要求4所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王崇龙，金善元，邵喜喜，效啸，周沈婷，俞相明，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：