草酸青霉中氧杂蒽酮的提取工艺及作为抗氧化剂上的应用制造技术

本发明专利技术公开了草酸青霉（

Extraction of oxaxanthone from Penicillium oxalate and its application as antioxidant

【技术实现步骤摘要】
草酸青霉中氧杂蒽酮的提取工艺及作为抗氧化剂上的应用
本专利技术涉及在草酸青霉(Penicilliumoxalicum)次生代谢产物中分离提取一杂氧蒽酮及其作为抗氧化试剂上的应用。
技术介绍
生物体在正常的代谢活动中因不完全氧化会产生各种自由基，它们具有较强的氧化能力，在正常情况下会被机体的内源性保护机制清除，但是一旦面临逆境胁迫，生物体的氧化应激反应诱导体内形成过多的自由基，从而指导生物体进入衰老和死亡。“抗氧化剂”(Antioxidant)一般是指抗氧化自由基的简称，通过提供与自由基结合的氢质子，自身发生氧化反应，来清理掉自由基或将自由基转化为隋性化合物，从而停止或减缓目标物质的氧化反应。抗氧化剂可以阻止机体自由基从细胞和其他组织夺取氧原子，防止自由基对正常细胞组织的破坏，从而提高生物体抵抗逆境胁迫的能力和抗衰老能力，进而起到预防与氧化应激相关疾病的作用。目前天然抗氧化产物的提取分离是一个难点，普遍存在提取工艺对物质结构有损伤，提取物有毒有残留并且不易分离，分离提取速度慢，效率低和成本高等一系列问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供于草酸青霉(Penicilliumoxalicum)代谢产物中分离提取一杂氧蒽酮，该氧杂蒽酮具有一定的抗氧化作用，且产量相对较高(约为0.75mg/L)，可用于制备抗氧化剂，为开发新的抗氧化剂提供了新选择。所述草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)是从疏花水柏枝(MyricariaLaxiflora)的叶中获得的内生真菌，于2017年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为PenicilliumoxalicumSY-15，保藏编号为，CCTCCNo：M2017025。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。本专利技术以草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)的发酵液酯相粗提物为主要活性部位，经旋转蒸发，薄板色谱(TLC)，柱层析，高效液相色谱分析(HPLC)等一系列分离提纯过程得到一酮类化合物，波普分析鉴定其结构为2,2,6-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮。具体工艺为：菌种活化：取草酸青霉菌菌株接种于PDA固体平板培养基中进行活化培养；培养：将活化好的草酸青霉菌菌株接种到PDA液体培养基上，恒温摇床培养，得到草酸青霉菌菌悬液；分离提取：将培养好的草酸青霉菌菌悬液过滤，弃去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液于30-45℃条件下减压浓缩获得浓缩液，冷冻干燥浓缩液，薄板色谱(TLC)，柱层析，高效液相色谱分析(HPLC)获得,提取物，即为本申请所述的杂氧蒽酮，化学式为2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮，结构式为：本专利技术所述得到的2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮呈淡黄色粉末。本专利技术目的是提供一种用于抗氧化剂的研究，其活性成分为2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮。抗氧化试验表明，DPPH自由基清除率为80.67％，总抗氧化为70.66U/mL，铁氰化钾还原力为1.43。附图说明图1为本专利技术HPLC分析图。图2为本专利技术的杂氧蒽酮2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮的碳谱图。图3为本专利技术的杂氧蒽酮2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮的氢谱图。图4为本专利技术的杂氧蒽酮2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮对在甲萘醌氧化胁迫下的酿酒酵母BY4742生长活性保护作用效果图，其中A为BY4742直接培养，B为添加氧化剂甲萘醌，C为添加氧化剂甲萘醌和抗氧化剂谷胱甘肽，D为添加氧化剂甲萘醌和抗氧化剂杂氧蒽酮。图5为本专利技术的杂氧蒽酮2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮不同浓度梯度对甲萘醌氧化胁迫下的酿酒酵母BY4742保护作用效果图，其中A为1mg/mL杂氧蒽酮，B为3mg/mL杂氧蒽酮，C为3mg/mL杂氧蒽酮。具体实施方式实施例1：草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)的活化培养菌种活化：取保存4℃冰箱的草酸青霉菌，挑起少许菌株接种于PDA(新鲜土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH7.2-7.5，121℃灭菌20min)固体平板培养基中，28℃培养箱培养7天。菌种培养：将活化好的菌株样品接种到200mLPDA(新鲜土豆200g/L，蔗糖20g/L，pH7.2-7.5，121℃灭菌20min)液体培养基上，置于28℃，120r/min的恒温摇床培养7天。草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)代谢产物的初步分离提取：将培养好的菌种通过真空抽滤装置过滤菌悬液，弃去菌体，把发酵液上清液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，将萃取液于40℃条件下减压浓缩获得浓缩液，冷冻干燥浓缩液获得粗提取物。粗提物用薄板色谱(TLC)(紫外254nm)及柱层析分析分离，在洗脱剂石油醚/丙酮体积比为1:3的浓度梯度下得到代谢产物，使用T-AOC法测定其抗氧化活性为94.23U/mL，在冰箱中4℃下保存。实施例2：杂氧蒽酮—2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮的分离提取HPLC(高效液相色谱分析)：取上述实施例1保存4℃温度的代谢产物配置成浓度为1mg/mL的溶液备用，取50μL进样分析(方法色谱条件:C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，波长210nm，流动相：A:水，B:乙腈(梯度脱洗)，柱温35℃，总流速1.0mL/min，进样量20μL)，选取出峰时间为18.5min的峰富集。波普分析：将收集样品富集浓缩冷冻干燥后采用各种经典色谱纯化技术和波普学技术以及理化性质，分离得到HPLC中18.5min的峰，结构鉴定为2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮(简称杂氧蒽酮)。实施例3：杂氧蒽酮—2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮体外抗氧化活性分析杂氧蒽酮以甲醇为溶剂配成1mg/mL的溶液，分别用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法、T-AOC试剂盒和铁氰化钾(PotassiumFerricyanide，PF)还原力测定法测定其抗氧化能力，重复3次，以相同浓度的谷胱甘肽作为正对照。结果显示杂氧蒽酮自由基清除率达到80.67％，T-AOC法测定其抗氧化活性为70.66U/mL，铁氰化钾还原力测定其吸光值为1.43，与抗氧化剂谷胱甘肽相差很小，具有较强的抗氧化能力。抗氧化活性测定结果如表1所示表1抗氧化活性测定结果抗氧化活性方法测定参考如下1.DPPH法测定抗氧化活性测定原理：DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色。当有自由基清除剂存在时，由于自由基清除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.草酸青霉中氧杂蒽酮的提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：/n菌种活化：取草酸青霉菌菌株接种于PDA固体平板培养基中进行活化培养；/n培养：将活化好的草酸青霉菌菌株接种到PDA液体培养基上，恒温摇床培养，得到草酸青霉菌菌悬液；/n分离提取：将培养好的草酸青霉菌菌悬液过滤，弃去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液于30-45℃条件下减压浓缩获得浓缩液，冷冻干燥浓缩液，薄板色谱(TLC)，柱层析，高效液相色谱分析(HPLC)获得提取物，即为本申请所述的氧杂蒽酮，化学式为2,2’,6’-三羟基-4-甲基-6-甲氧基-酰基-二苯基甲酮，结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.草酸青霉中氧杂蒽酮的提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：
菌种活化：取草酸青霉菌菌株接种于PDA固体平板培养基中进行活化培养；
培养：将活化好的草酸青霉菌菌株接种到PDA液体培养基上，恒温摇床培养，得到草酸青霉菌菌悬液；
分离提取：将培养好的草酸青霉菌菌悬液过滤，弃去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液于30-45℃条件下减压浓缩获得浓缩液，冷冻干燥浓缩液，薄板色谱(TLC)，柱层析，高效液相色谱分析(HPLC)获得提取物，即为本申请所述的氧杂蒽酮，化学式为2,2’,6’-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士平，刘欢，杨宇纯，薛艳红，刘呈雄，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42