一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法技术

本发明专利技术公开了一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：制备破囊壶菌菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择紫外光，取菌悬液均匀平铺在培养皿底部，加入灭菌后的磁子，搅拌，紫外照射，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释，均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，避光培养；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落发酵培养，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。本发明专利技术的方法操作简单，成本低，且时间短。经过本发明专利技术的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。

Breeding method of a high yield DHA producing strain

【技术实现步骤摘要】
一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法
本专利技术属于工业发酵生产用产二十二碳六烯酸(DHA)的高产菌株的选育，特别涉及的一种海洋破囊壶菌进行紫外诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。
技术介绍
二十二碳六烯酸(DHA)俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，因其含有6个不饱和烯键的特有结构，使它具有独特的生理功能和经济价值，对人类健康有着特殊的作用和影响，但人体和动物不能合成，因此必须从食物中获取足够的DHA，并且随着生活水平的提高，人们也越来越重视DHA的补充。破囊壶菌(Thraustochytrids)是一类异养的专性海生真菌类原生生物，近年来由于其富含多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)，尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexanoicacid，DHA)而备受关注。在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。利用简便高效的诱变方法处理微生物，使其在非自然条件下大幅度提高随机突变频率，然后从中挑选符合要求的高产突变株。提高DHA的产量势在必行，而在众多技术中，优良菌株的选育工作是其中的重要组成部分，一个高产菌株可以直接提高发酵效率，带来巨大的经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的存在的所诱变的菌株DHA产量较低的不足，提供一种操作简单、高效廉价的高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25-35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15-20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2-3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10-20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50-100μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15-30℃恒温培养箱中避光培养24-48h；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15-30℃、150-200r/min培养3-5d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。本专利技术的优点：本专利技术的方法操作程序简单，成本低，且时间短，突变效果明显，易于推广。经过本专利技术的方法获得的菌株，较野生株DHA产量提高最多可达32％，经济效益显著。附图说明图1是野生株和突变株的生物量及DHA产量对比图。图2是突变株的稳定性考察。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。本申请各实施例以破囊壶菌Aurantiochytriumsp.ZJWZ-7菌为例，但并不对本专利技术作任何限制，其它的野生破囊壶菌也可以用于本专利技术。实施例1一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热30min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液18mL均匀平铺在培养皿底部，加入2粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射15s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取80μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在20℃恒温培养箱中避光培养36h；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在20℃、180r/min培养4d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。测定生物量收集15mL步骤(3)获得的培养液，于已称重的离心管中，8000r/min离心10min，，倒掉上清液，离心管中剩余沉淀用无菌水清洗2次，-80℃冷冻2h，置于冷冻干燥机中48h后取出，称量冻干后离心管重量。培养液中的生物量即为冻干后离心管重量减去空离心管重量，见图1。测定DHA产量。取冻干称重后的菌体加入2ml的质量浓度4％的硫酸甲醇溶液中，加入100μl内标(1g/L十九烷酸)，80℃水浴1h后取出冷却，加入1ml灭菌水，1ml正己烷，充分混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量，见图1。突变株遗传稳定性测试将步骤(3)获得的菌连续传至10代，再对其隔代进行摇瓶发酵培养，测定生物量和DHA产量并与初代进行比较，观察其遗产稳定性见图2。实施例2一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15mL均匀平铺在培养皿底部，加入3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射10s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释100倍，取50μL均匀涂布在新鲜的M4平板培养基上，用锡箔纸包住，在15℃恒温培养箱中避光培养48h；(3)观察M4平板培养基上菌落大小及长势情况，挑选出形态大，表面光滑的单菌落为初筛，将初筛获得的单菌落在发酵培养基中进行发酵培养，在15℃、150r/min培养3d，检测其生物量及DHA产量，筛选出能够稳定遗传的高产二十二碳六烯酸的破囊壶菌菌株。实验证明，本实施例获得高产DHA的菌株。实施例3一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，包括如下步骤：(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距离为15cm，紫外照射20s，设3个平行，将紫外照射后的菌液再用无菌生理盐水稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在10

【技术特征摘要】
1.一种高产二十二碳六烯酸破囊壶菌菌株的育种方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将经过菌种活化、种子培养、摇瓶发酵培养至对数期的破囊壶菌菌液，离心去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在107～109CFU/mL的菌悬液；
(2)在黑暗环境中，选择254nm紫外光，预先将紫外灯预热25-35min，稳定光源，在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液15-20mL均匀平铺在培养皿底部，加入2-3粒灭菌后的磁子，随后将培养皿置于磁力搅拌器之上，搅拌，照射垂直距...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪光义，姚力芬，汪伟骏，叶会科，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12