一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用，所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。本发明专利技术还提出了所述探针体系在用于基因SNP位点检测的反应体系、基因SNP位点的检测方法及耳聋基因SNP位点的检测中的应用，该方法用于检测耳聋基因相关SNP位点中，对16个耳聋基因相关SNP位点的检测准确率高达100％。

A probe system for SNP site detection and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用
本专利技术涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种用于基因SNP位点检测的探针体系及其应用。
技术介绍
单核苷酸多态性(SNP，singlenucleotidepolymorphism)位点是指人与人之间一个碱基之间的差异，是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，基因组序列差异包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入和缺失等。人与人的基因序列中有99.9％以上的序列都是相同的，仅有0.1％不同，即1000个碱基中有1个不同，人类基因组有30亿对碱基，按此计算，整个人类基因组中有300万个碱基不同。通常这300万个不同的碱基被称为SNP是由个人的遗传背景决定的，在目前的研究中，SNP位点可以作为临床具有意义的诊断标志物(Marker)，在临床上具有重大的意义，能够用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。目前检测SNP位点的方法主要有测序法、芯片法和Taqman法。其中，测序法非常准确，但是价格也非常高，不适用于大样本量的检测；芯片法适用于超多位点分析，但是芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测，因此准确性较低；Taqman法准确性高，适用于大样本，但是价格比较贵。因此，开发一种低价、高效且适用于大样本检测的基因SNP位点检测的方法具有十分重要的意义。根据2006年全国残疾人调查最新统计数据，我国听力言语残疾者达2780万，并且每年有3万左右聋儿出生，还有6～8万患有迟发性耳聋的患儿被发现，其中大部分为重度或极重度感音神经性耳聋。这一类耳聋严重影响患者的交流和认知能力，对个人、家庭和社会造成巨大的负担。随着人类基因组计划的完成，遗传性耳聋的病因学研究取得很大进展，推测2/3的先天性感音神经性耳聋由遗传因素导致。非综合征型耳聋占所有遗传性耳聋的70％，这其中的80％为常染色体隐性遗传，15％为常染色体显性遗传，其他5％为线粒体或X连锁遗传。虽然耳聋相关基因很多，但绝大部分耳聋患者是由少数几个单基因的缺损导致。解放军总医院聋病分子诊断中心自2004年起进行了全国范围的聋病分子流行病学调查，确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因mtDNA(A1555G和C1494T突变)是导致中国大部分遗传性耳聋发生的3个最为常见的耳聋基因，发现21％的耳聋患者带有GJB2突变；14.5％的带有SLC26A4突变，另外分别有3.4％和0.6％的患者带有mtDNAA1555G和C1494T突变。GJB2突变主要导致先天性非综合征型耳聋，为常染色体隐性遗传模式。其主要突变为235delC。通过基因诊断明确的GJB2耳聋，在明确病因的基础上，还可以排除其他神经系统疾病，提示耳蜗神经和听觉中枢的完整性，多项研究表明此类患儿接受人工耳蜗植入后听力语言康复效果好，是人工耳蜗手术前一项理想的效果预测检查。SLC26A4突变可以造成两种临床表现，一种是Pendred综合征，表现为甲状腺肿大和耳聋；另一种在中国最为常见，患儿仅表现为耳聋，CT检查可发现前庭导水管扩大，称为大前庭水管综合征(en-largedvestibularaqueductsyndrome，EVAS)。我国EVAS占儿童期耳聋发病比例的20％～28％。其病因是由于联系颅腔与内耳的通道异常扩大，凡是引起颅内压变化的因素如轻度的头部碰撞、感冒等就能引起EVAS患儿听力下降。在我国的EVAS耳聋患者中，SLC26A4基因突变的检出率达97％左右，主要突变是c.919A>G。线粒体基因mtDNAA1555G与C1494T突变导致的耳聋主要与氨基糖甙类药物使用有关。突变携带者对氨基糖甙类药物异常敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至严重的听力下降。由于其遵循母系遗传方式，即此类突变基因的遗传只通过女性直接传给后代，如果在家族中有1例，就可推算出这个家族中至少有10例携带这类突变基因。若母亲携带此类突变基因，可提醒其本人和后代一定要禁止使用氨基糖甙类药物，避免发生耳聋；同时，在家族中确诊1例即可作为全家族的用药指导，由此阻断耳聋在家族中继续发生。因此，通过耳聋基因SNP筛查，筛查出的mtDNAA1555G与C1494T突变携带者能通过禁止使用氨基糖甙类抗生素有效避免药物性耳聋的发生；GJB2耳聋患者，提示人工耳蜗预后良好，可直接进入听力康复程序。SLC26A4耳聋患者,提示为EVAS患儿，通过采取严格防护措施，可尽量保持患儿有效听力。并且耳聋基因诊断还可以为耳聋患者及耳聋家庭的婚配生育提供科学准确的遗传信息与指导。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于基因SNP位点检测的探针体系，能够高效检测基因SNP位点进行基因分型。本专利技术还提出一种用于基因SNP位点检测的反应体系。本专利技术还提出一种基因SNP位点的检测方法。本专利技术还提出上述基因SNP位点的检测方法的应用。根据本专利技术的第一方面实施例的一种用于基因SNP位点检测的探针体系，所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。根据本专利技术的第一方面实施例的探针体系，至少具有如下有益效果：本专利技术中不同SNP位点可以使用同一套探针体系，与Taqman方法相比大大节省了检测成本尤其是研发成本。根据本专利技术的一些实施例，所述探针对选自以下4种探针对，探针对1包括核苷酸序列为SEQIDNO.1的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.2的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；探针对2包括核苷酸序列为SEQIDNO.3的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.4的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；探针对3包括核苷酸序列为SEQIDNO.5的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.6的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；探针对4包括核苷酸序列为SEQIDNO.7的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.8的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列。根据本专利技术的一些实施例，所述荧光基团修饰包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX和TAMRA中的至少一种；所述淬灭基团修饰包括BHQ-1和BHQ-2中的至少一种。根据本专利技术的第二方面实施例的一种用于基因SNP位点检测的反应体系，所述所述反应体系包括上述的探针体系和针对SNP位点设计的引物组；每个所述引物组中包括1条野生型引物序列和1条突变型引物序列；所述野生型引物和突变型引物中均含有对应探针对中带有荧光基团的探针的寡核苷酸序列。作为优选的，所述引物组的寡核苷酸序列由对应5’端荧光基团修饰的探针的寡核苷酸序列和SNP位点特异性引物序列构成。根据本专利技术的第二方面实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述探针体系中至少包含2个探针对；每个探针对包括5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和相应互补结合的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；每个探针对的荧光基团不同；所述5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值不超过3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列的Tm值。


2.根据权利要求1所述的用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述探针对选自以下4种探针对，探针对1包括核苷酸序列为SEQIDNO.1的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.2的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对2包括核苷酸序列为SEQIDNO.3的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.4的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对3包括核苷酸序列为SEQIDNO.5的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.6的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列；
探针对4包括核苷酸序列为SEQIDNO.7的5’端荧光基团修饰的寡核苷酸序列和核苷酸序列为SEQIDNO.8的3’端淬灭基团修饰的寡核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的用于基因SNP位点检测的探针体系，其特征在于：所述荧光基团修饰包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX和TAMRA中的至少一种；所述淬灭基团修饰包括BHQ-1和BHQ-2中的至少一种。


4.一种用于基因SNP位点检测的反应体系，其特征在于：所述反应体系包括如权利要求1至3任一项所述的探针体系和针对SNP位点设计的引物组；每个所述引物组中包括1条野生型引物序列和1条突变型引物序列；所述野生型引物和突变型引物中均含有对应探针对中带有荧光基团的探针的寡核苷酸序列。


5.根据权利要求4所述的用于基因SNP位点检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆，王益民，高堂杰，周巧，曹叶，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43